《表紙》
(19)【発行国】日本国特許庁（ＪＰ）
(12)【公報種別】公表特許公報（Ａ）
(11)【公表番号】特表２００１−５２７３９５（Ｐ２００１−５２７３９５Ａ）
(43)【公表日】平成１３年１２月２５日（２００１．１２．２５）
(54)【発明の名称】植物における長鎖多不飽和脂肪酸の合成のための方法および組成物
(51)【国際特許分類第７版】
C12N 15/09 ZNA
A01H 5/00
A23D 9/007
A23K 1/16 304
A23L 1/30
A61K 31/20
A61P 3/02
C11B 1/00
C11C 3/00
C12N 5/10
//(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:645 )
【ＦＩ】
A01H 5/00 A
A23K 1/16 304 C
A23L 1/30 Z
A61K 31/20
A61P 3/02
C11B 1/00
C11C 3/00
C12R 1:645 )
C12N 15/00 ZNA A
5/00 C
A23D 9/00 518
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
【全頁数】２２９
(21)【出願番号】特願平１０−５４４１７５
(86)(22)【出願日】平成１０年４月１０日（１９９８．４．１０）
(85)【翻訳文提出日】平成１１年１０月６日（１９９９．１０．６）
(86)【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４２１
(87)【国際公開番号】ＷＯ９８／４６７６４
(87)【国際公開日】平成１０年１０月２２日（１９９８．１０．２２）
(31)【優先権主張番号】０８／８３３，６１０
(32)【優先日】平成９年４月１１日（１９９７．４．１１）
(33)【優先権主張国】米国（ＵＳ）
(31)【優先権主張番号】０８／８３４，０３３
(32)【優先日】平成９年４月１１日（１９９７．４．１１）
(33)【優先権主張国】米国（ＵＳ）
(31)【優先権主張番号】０８／８３４，６５５
(32)【優先日】平成９年４月１１日（１９９７．４．１１）
(33)【優先権主張国】米国（ＵＳ）
(31)【優先権主張番号】０８／９５６，９８５
(32)【優先日】平成９年１０月２４日（１９９７．１０．２４）
(33)【優先権主張国】米国（ＵＳ）
(81)【指定国】ＥＰ（ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ），ＯＡ（ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ），ＡＰ（ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ），ＥＡ（ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ），ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(71)【出願人】
【氏名又は名称】カルジーン エル エル シー
【住所又は居所】アメリカ合衆国 ９５６１６ カリフォルニア州，デイビス，フィフス ストリート １９２０
(71)【出願人】
【氏名又は名称】アボット ラボラトリーズ
【住所又は居所】アメリカ合衆国 ６００６４—３５００ イリノイ州，アボット パーク，アボット パーク ロード １００
(72)【発明者】
【氏名】ナットゾン，デボラ
【住所又は居所】アメリカ合衆国 ９５７４６ カリフォルニア州，グラナイト ベイ，ロックハースト ウェイ ６１１０
(72)【発明者】
【氏名】ムカージ，プラディプ
【住所又は居所】アメリカ合衆国 ４３２３０ オハイオ州，ガハンナ，アルカロ ドライブ １０６９
(72)【発明者】
【氏名】フアング，ヤン−シェン
【住所又は居所】アメリカ合衆国 ４３２２０ オハイオ州，アッパー アーリントン，ダンバーズ コート ２４６２
(72)【発明者】
【氏名】サーモンド，ジェニファー
【住所又は居所】アメリカ合衆国 ４３２３１ オハイオ州，コロンバス，アディロンダック ３７０２
(72)【発明者】
【氏名】チョーダリー，スニタ
【住所又は居所】アメリカ合衆国 ７７５８４ テキサス州，パーランド，ウッドバイン プレイス ３４１９
(72)【発明者】
【氏名】レオナルド，アマンダ，エウン−ヨン
【住所又は居所】アメリカ合衆国 ４３２３０ オハイオ州，ガハンナ，シェードウッド コート ５８１
(74)【代理人】
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔 （外２名）
(57)【要約】
本発明は、植物、植物部位および植物細胞、例えば葉、根、果実および種子などにおいて、多不飽和長鎖脂肪酸を調製するための組成物および方法に関する。Δ5-デサチュラーゼ、Δ6-デサチュラーゼおよびΔ12-デサチュラーゼを含む脂肪酸デサチュラーゼをコードする核酸配列および構築物を使用して、１以上のデサチュラーゼをコードする１以上のトランスジーンを含み且つ発現するトランスジェニック植物、植物部位および細胞を作出する。植物系における異なる基質特異性を有するデサチュラーゼの発現により、植物、植物部位および組織の脂肪酸プロフィールの改変のための多不飽和長鎖脂肪酸（ドコサヘキサン酸、エイコサペンタン酸、α-リノレン酸、γ-リノレン酸、アラキドン酸などの）の大量生産が可能となる。脂肪酸プロフィールの操作により、商品価値のある新規植物油および製品の生産が可能となる。
【特許請求の範囲】
１．配列番号１、配列番号３、およひ配列番号５からなる群より選択される配列
番号に示す１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、該１つ
以上のヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列と連結している、上記の核
核酸構築物。
２． 配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群より選択される配
列番号に示す１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、該１
つ以上のヌクレオチド配列が植物細胞において機能する発現制御配列と機能
しうる形で連結されている、上記の核酸構築物。
３． 前記核酸配列が約60%未満の平均A+T含有量を有する、請求項２に記載の核
酸構築物
４． 前記核酸配列が真菌に由来する、請求項２に記載の核酸構築物。
５． 前記真菌がMortjerella属のものである、請求項４に記載の核酸構築物
６． 前記真菌がalpin種のものである、請求項５に記載の核酸構築物。
７． 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む核酸構築物であって、該ヌクレオチド配列が植物細胞で機能
する転写制御配列または発現制御配列と機能しうる形で連結され、脂肪酸分
子を該脂肪酸分子のカルボキシル末端から６番目の炭素で不飽和化する機能
的活性ポリペプチドをコードする、上記の核酸構築物。
８． 配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む核酸構築物であって、該ヌクレオチド配列が植物細胞で機能
する転写制御配列または発現制御配列と機能しうる形で連結され、脂肪酸分
子を該脂肪酸分子のカルボキシル末端から12番目の炭素で不飽和化する機能
的活性ポリペプチドをコードする、上記の核酸構築物。
９． 配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む核酸構築物であって、該ヌクレオチド配列が植物細胞で機能
する転写制御配列または発現制御配列と機能しうる形で連結され、脂肪酸分
子を該脂肪酸分子のカルボキシル末端から５番目の炭素で不飽和化する機能
的活性ポリペプチドをコードする、上記の核酸構築物。
10． 配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群より選択される配
列番号に示すアミノ酸配列を有する機能的活性デサチュラーゼをコードする
少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、該ヌクレオ
チド配列が植物細胞で機能するプロモーターと機能しうる形で連結されてい
る、上記の核酸構築物。
11． 前記植物細胞が種子細胞である、請求項10に記載の核酸構築物
12． 前記種子細胞が胚細胞である、請求項11に記載の核酸構築物。
13． 多不飽和脂肪酸の産生をもたらす少なくとも１つの機能的活性
Mortierella alpina脂肪酸デサチュラーゼをコードする少なくとも１コピー
のDNA配列を含む組換え植物細胞であって、該脂肪酸デサチュラーゼは配列
番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群より選択される配列番号
に示すアミノ酸配列を有し、該細胞は該DNA配列を含むベクターで形質転換
され、該DNA配列は発現制御配列と機能しうる形で連結されている、上記の
組換え植物細胞。
14． 前記多不飽和脂肪酸がLA、ARA、GLA、DGLA、SDAおよびEPAからなる群より
選択される、請求項13に記載の組換え植物細胞。
15． 前記組換え植物細胞が18:1、18:2、18:3および18:4からなる群より選択さ
れる脂肪酸に富んでいる、請求項13に記載の組換え植物細胞。
16． 前記植物細胞がナタネ、大豆、ベニバナ、トウモロコシ、亜麻およびヒマ
ワリからなる群より選択される、請求項15に記載の組換え植物細胞。
17． 前記発現制御配列が前記植物細胞に対して内因性である、請求項16に記載
の組換え植物細胞。
18． 請求項16の組換え植物細胞によって発現される１つ以上の植物油。
19． 脂肪酸分子を該脂肪酸分子のカルボキシル末端から５番目の炭素で不飽和
化するトランスジーン発現産物をコードするトランスジーンを含む細胞を有
する植物を栽培する工程を含む改変型長鎖多不飽和脂肪酸生合成を得るため
の方法であって、該トランスジーンが発現されて該細胞において長鎖不飽和
脂肪酸生合成が改変されるような条件下で該トランスジーンが発現制御配列
と機能しうる形で連結している、上記の方法。
20． 真菌または藻類に由来し、脂肪酸分子を該脂肪酸分子のカルボキシル末端
から５番目の炭素、６番目の炭素および12番目の炭素からなる群より選択さ
れる炭素で不飽和化するトランスジーン発現産物をコードする１つ以上のト
ランスジーンを含む細胞を有する植物を栽培する工程を含む改変型長鎖多不
飽和脂肪酸生合成を得るための方法であって、該１つ以上のトランスジーン
が発現されて該細胞において長鎖不飽和脂肪酸生合成が改変されるような条
件下で該トランスジーンが発現制御配列と機能しうる形で連結している、上
記の方法。
21． 前記長鎖多不飽和脂肪酸が、LA、ARA、GLA、DGLA、SDAおよびEPAからなる
群より選択される、請求項19または20に記載の方法。
22． 請求項19または20の方法により産生される、植物油またはその画分。
23． 治療または予防をもたらすのに十分な量の請求項22の植物油を、治療また
は予防を必要とする患者に投与することを含む、栄養不良を治療または予防
するための方法。
24． 請求項22の植物油または画分、および製薬上許容可能な担体を含む医薬組
成物。
25． 固体または液体の形態である、請求項24に記載の医薬組成物。
26． カプセルまたは錠剤の形態である、請求項25に記載の医薬組成物。
27． ビタミン、ミネラル、炭水化物、糖、アミノ酸、遊離脂肪酸、リン脂質、
抗酸化剤およびフェノール化合物からなる群より選択される少なくとも１つ
の栄養素をさらに含む、請求項24記載の医薬組成物。
28． 請求項22に記載の植物油またはその画分を含む栄養配合物。
29． 前記栄養配合物が、乳幼児用配合物、食物補充剤および食物代用物からな
る群より選択される、請求項28に記載の栄養配合物。
30． 前記乳幼児用配合物、食物補充剤および食物代用物が液体または固体の形
態である、請求項29に記載の栄養配合物。
31． 請求項22に記載の植物油または画分を含む乳幼児用配合物。
32． ヤシ油、大豆油、カノラ油、モノおよびジグリセリド、グルコース、食用
ラクトース、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、乳ホエー、大
豆タンパク質ならびに他のタンパク質加水分解物からなる群より選択される
少なくとも１つの多量栄養素をさらに含む、請求項31に記載の乳幼児用配合
物。
33． ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＢ複合体からなる群より選択される少なく
とも１つのビタミン、ならびにカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン
、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄から
なる群より選択される少なくとも１つのミネラルをさらに含む、請求項32に
記載の乳幼児用配合物。
34． 請求項22に記載の植物油またはその画分を含む食物補充剤。
35． ヤシ油、大豆油、カノラ油、モノおよびジグリセリド、グルコース、食用
ラクトース、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、乳ホエー、大
豆タンパク質ならびに他のタンパク質加水分解物からなる群より選択される
少なくとも１つの多量栄養素をさらに含む、請求項34に記載の食物補充剤。
36． ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＢ複合体からなる群より選択される少なく
とも１つのビタミン、ならびにカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン
、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄から
なる群より選択される少なくとも１つのミネラルをさらに含む、請求項35に
記載の食物補充剤。
37． ヒトまたは動物に投与される、請求項34または36に記載の食物補充剤。
38． 請求項22の植物油またはその画分を含む食物代用物。
39． ヤシ油、大豆油、カノラ油、モノおよびジグリセリド、グルコース、食用
ラクトース、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、乳ホエー、大
豆タンパク質ならびに他のタンパク質加水分解物からなる群より選択される
少なくとも１つの多量栄養素をさらに含む、請求項38に記載の食物代用物。
40． ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＢ複合体からなる群より選択される少なく
とも１つのビタミン、ならびにカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン
、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄から
なる群より選択される少なくとも１つのミネラルをさらに含む、請求項39に
記
載の食物代用物。
41． ヒトまたは動物に投与される、請求項38または40に記載の食物代用物。
42． 治療をもたらすのに十分な量の請求項38の食物代用物または請求項34の食
物補充剤を患者に投与することを含む、多飽和脂肪酸の不十分な摂取または
産生により引き起こされる状態を有する患者を治療する方法。
43． 前記食物代用物または前記食物補充剤が経腸的または非経口的に投与され
る、請求項42に記載の方法。
44． 請求項22の植物油またはその画分を含む、化粧品。
45． 局所塗布される、請求項44に記載の化粧品。
46． ヒトまたは動物に投与される、請求項24に記載の医薬組成物。
47． 請求項22の植物油またはその画分を含む、動物用食餌。
48． 配列番号38〜配列番号44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含
む単離されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は植物細胞に
おいて発現される、上記のヌクレオチド配列。
49． 前記真菌がNortierella種である、請求項20に記載の方法。
50． 前記真菌がMorierella alpinaである、請求項49に記載の方法。
51． 配列番号49〜配列番号50からなる群より選択される、単離されたヌクレオ
チド配列であって、該配列は植物細胞において発現される、上記のヌクレオ
チド配列。
【発明の詳細な説明】
植物における長鎖多不飽和脂肪酸の合成のための方法および組成物
関連出願
本出願は、1997年４月11日付け米国特許出願第08/834,655号の一部継続出願で
あり、1997年４月11日付け米国特許出願第08/833,610号、1997年４月11日付け米
国特許出願第08/834,033号、および1997年10月24日付け米国特許出願第08/956,9
85号の一部継続出願であり、その開示内容は本明細書中に参考として組み込まれ
る。
序論
発明の分野
本発明は、宿主植物における長鎖多不飽和脂肪酸（PUFAS）の産生量を変える
ことができる酵素および／または酵素成分のレベルのモジュレーションに関する
。本発明は、植物におけるPUFASの産生により例示する。
背景
多不飽和脂肪酸（PUFA）の２つの主要ファミリーは、アラキドン酸などのω3
脂肪酸およびエイコサペンタエン酸などのω6脂肪酸である。PUFAは細胞の形質
膜の重要な成分であり、それは該形質膜においてリン脂質のような形態で見出さ
れうる。また、PUFAは、プロスタサイクリン、ロイコトリエン、およびプロスタ
グランジンなどのヒトおよび動物において重要な他の分子の前駆体として機能す
る。PUFAは、適切な発達、特に乳幼児の脳の発達、ならびに組織の形成および修
復に必要である。
重要な４つの主要長鎖PUFAには、種々のタイプの魚油中に主として見出される
ドコサヘキサエン酸（DHA）およびエイコサペンタン酸(EPA)、メマツヨイグサ(O
enothera biennis)、ルリチシャ(Borago officinalis)およびクロフサスグリ（R
ibesnigrum）などの多数の植物の種子中に見出されるγ-リノレン酸
(GLA)、ならびに海洋油および植物種子中に見出されるステアリドン酸（SDA）が
含まれる。GLAおよびもう１つの重要な長鎖PUFAであるアラキドン酸（ARA）は共
に、糸状菌中で見出される。ARAは、肝臓、副腎などの動物組織から精製するこ
とができる。
DHAに関しては、種々の海洋生物、冷水海洋魚から得た油および卵黄画分など
の多数の商業的製造起源が存在する。ARAに関しては、Mortierella属、Entomoph
thora属、Phytium属およびPorphyridium属を含む微生物を、商業的製造に使用す
ることができる。SDAの商業的起源には、Trjchodesma属およびEchium属が含まれ
る。GLAの商業的起源には、メマツヨイグサ、クロフサスグリおよびルリチシャ
が含まれる。しかしながら、天然起源からPUFAを商業的に製造することに関連し
たいくつかの欠点がある。動物、植物などのPUFAの天然起源は、非常に不均一な
油組成を有する傾向にある。したがって、これらの起源から得た油は、１以上の
所望のPUFAを分離したり又は１以上のPUFAに富む油を製造するためには、徹底的
な精製を要する可能性がある。また、天然起源は、入手可能性において、制御で
きない変動にさらされる。魚類のストック（stocks）は、自然変異を受けたり、
あるいは乱獲により枯渇する可能性がある。魚油は不快な風味および香りを有し
、それは、所望の製品から経済的に分離することが不可能な場合があり、そのよ
うな製品を食物補充剤として許容できなくする場合がある。動物油、および特に
魚油は、環境汚染物質を蓄積する可能性がある。天候および疾患が、魚および植
物の両方の起源からの収量の変動を引き起こす可能性がある。代替油産生作物の
生産のための利用可能な農耕地は、人口の一定の増加と、それに関連した、残り
の耕地上の食物生産に対する需要の増加とからの競合にさらされる。PUFAを産生
する作物（例えば、ルリチシャ）は、商業的栽培に順応化されておらず、単一栽
培においては十分に得られない可能性がある。したがって、そのような作物の栽
培は、より有益かつ定評ある作物の栽培が可能な場合には、経済的な競争力を有
さない。また、Mortierellaなどの生物の大規模発酵は非常に高くつく。天然動
物組織は、少量のARAしか含有せず、加工が困難である。Porphyridium、Mortier
ellaなどの微生物は、商業的規模で培養することが困難である。
PUFAを含有する食物補充剤および医薬製剤は、PUFA源の欠点を保有している可
能性がある。魚油カプセルなどの補充剤は、特定の所望の成分を低レベルでしか
含有していないことがあり、したがって大用量を要する。高用量は、汚染物を含
む望ましくない成分の高レベル摂取につながる。過剰添加は、内因性生合成経路
の阻害を引き起こし、in vivoにおける種々の脂質画分中の他の必要な脂肪酸と
の競合を引き起こし、望ましくない結果を招く可能性があるため、脂肪酸補充剤
を与える際には注意しなければならない。例えば、ω3脂肪酸に富む食物を摂取
するエスキモー人は、高い出血傾向を有する(米国特許第4,874,603号)。該補充
剤の不快な風味および香りは、そのような投与計画を望ましくないものにするこ
とがあり、患者による応諾を妨げる可能性がある。
PUFAの生合成には多数の酵素が関与している。リノール酸（LA，18:2 Δ9,12
）は、Δ12-デサチュラーゼによりオレイン酸（18:1Δ9）から産生される。GLA
（18:3 Δ6，9，12）は、Δ6-デサチュラーゼによりリノール酸（LA，18:2 Δ9
，12）から産生される。DGLA（20:3 Δ8，11，14）からのARA（20:4 Δ5，8，11
，14）の産生は、Δ5-デサチュラーゼにより触媒される。しかしながら、動物は
、Δ9位を超えて不飽和化することができないため、オレイン酸（18:1Δ9）をリ
ノール酸（18:2 Δ9，12）に変換することができない。同様に、哺乳類は、α-
リノレン酸（ALA，18:3 Δ9，12，15）を合成することができない。真菌および
植物を含む他の真核生物は、Δ21およびΔ15位で不飽和化する酵素を有する。し
たがって、動物の主要な多不飽和脂肪酸は、食物に由来するか、および／または
、リノール酸（18:2 Δ9，12）もしくは∝リノレン酸(18:3 Δ9，12，15）の不
飽和化および伸長に由来する。
多不飽和脂肪酸は、栄養学的、薬学的、産業的な目的や、他の目的において有
用であると考えられる。天然起源から得た、および化学合成による多不飽和脂肪
酸の供給の拡大では、商業的な需要には十分ではない。したがって、これらの脂
肪酸を天然で産生する種から、PUFAの生合成に関与する遺伝物質を得ること、お
よび商業的量の１以上のPUFASを産生するよう操作することができる異種系にお
いて該単離物を単独でまたは組み合わせで発現させることに、関心が持たれてい
る。
本発明はさらに、本発明の長鎖脂肪酸を含む液体または固体の形態である、配
合物または食物補充剤に関する。これらの配合物および補充剤は、ヒトまたは動
物に投与することができる。
本発明の配合物および補充剤は、ヤシ油、大豆油、カノラ油、モノおよびジグ
リセリド、グルコース、食用ラクトース、電気透析されたホエー、電気透析され
た脱脂乳、乳ホエー、大豆タンパク質ならびに他のタンパク質加水分解物よりな
る群から選ばれる少なくとも１つの多量栄養素を更に含むことが可能である。
本発明の配合物は、ビタミンA、C、D、EおよびB複合体よりなる群から選ばれ
る少なくとも１つのビタミンと、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、
ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレンおよび鉄よりなる群
から選ばれる少なくとも１つのミネラルとを更に含むことが可能である。
本発明はさらに、多不飽和脂肪酸の不十分な摂取または産生により引き起こさ
れる状態を有する患者の治療方法であって、該患者の治療を行なうのに十分な量
の本発明の食物代用物を該患者に投与することを含んでなる方法に関する。
本発明はさらに、本発明の物質の化粧用および医薬組成物に関する。
本発明はさらに、製薬上許容される担体中のトランスジェニック油に関する。
本発明はさらに、トランスジェニック油を含有する栄養補充剤、化粧剤および乳
幼児用配合物に関する。
本発明はさらに、脂肪酸分子を該脂肪酸分子のカルボキシル末端から5、5また
は12番目の炭素において不飽和化するトランスジーン発現産物をコードするトラ
ンスジーンを含有する細胞を有する微生物を増殖させる工程を含んでなる、改変
された長鎖多不飽和脂肪酸生合成を得るための方法であって、該トランスジーン
が発現されて該細胞内の長鎖多不飽和脂肪酸の生合成が改変される条件下、該ト
ランスジーンが、機能しうる形で発現制御配列に連結されていることを特徴とす
る方法に関する。
本発明はさらに、ビタミン、ミネラル、炭水化物、糖、アミノ酸、遊離脂肪酸
、リン脂質、抗酸化剤およびフェノール化合物からなる群より選択される少なく
とも１つの栄養素を含む、医薬組成物に関する。
関連文献
Δ6-デサチュラーゼによるγ-リノレン酸の製造は、米国特許第5,552,306号お
よび米国特許第5,614,393号に記載されている。Mofortierella alpinaを使用す
る8,11-エイコサジエン酸の製造は、米国特許第5,376,541号に開示されている。
双鞭毛藻類によるドコサヘキサエン酸の製造は、米国特許第5,407,957号に記載
されている。ルリチシャからのΔ6-デサチュラーゼのクローニングは、PCT公開W
O 96/21022に記載されている。Δ9-デサチュラーゼのクローニングは、公開され
ている特許出願PCT WO 91/13972、EP 0 550 162 ALEP 0 561 569 A2、EP 0 644
263 A2およびEP 0 736 598 A1および米国特許第5,057,419号に記載されている。
種々の生物からのΔ12-デサチュラーゼのクローニングは、PCT公開WO 94/11516
および米国特許第5,443,974号に記載されている。種々の生物からのΔ15-デサチ
ュラーゼのクローニングは、PCT公開WO 93/11245に記載されている。Thumbergia
alataからのΔ６パルミトイル-アシル輸送タンパク質デサチュラーゼおよび大
腸菌中でのその発現は、米国特許第5,614,400号に記載されている。35Sプロモー
ターを用いたトランスジェニック大豆胚における大豆ステアリル-ACPデサチュラ
ーゼの発現は、米国特許第5,443,974号に開示されている。
発明の概要
植物および植物細胞における多不飽和長鎖脂肪酸およびデサチュラーゼの製造
のための新規組成物および方法を提供する。該方法は、宿主植物細胞内で機能す
る発現カセットで形質転換した目的の宿主植物細胞を増殖することを含み、該発
現カセットは、PUFAの産生をモジュレートすることができるデサチュラーゼポリ
ペプチドをコードするDNA配列にリーディングフレーム5'で結合した転写および
翻訳開始制御領域を含んでなる。該デサチュラーゼポリペプチドの発現は、PUFA
生合成に関与する酵素の濃度の変化の結果として、宿主植物細胞の該PUFAのプロ
フィールの変化をもたらす。特に興味深いのは、植物組織および／または葉、根
、果実および種子などの植物部位におけるPUFA産生の選択的制御である。本発明
は、例えばDHA、EPA、ARAおよびGLAの大量生産、および食用植物組織お
よび／または植物部位の脂肪酸プロフィールの修正に有用である。
本発明はさらに、配列番号1〜配列番号52に記載のヌクレオチドおよびペプチ
ド配列に実質的に関連するまたは相同である精製されたヌクレオチド配列または
ポリペプチド配列をさらに含む。本発明はさらに、発現系の成分として及びトラ
ンスジェニック油の製造に有用な系の成分として関連配列を同定するためのプロ
ーブとして、配列番号1〜40に記載の配列を使用する方法に関する。
図面の簡単な説明
図１は、藻類、Mortierellaおよびヒトを含む種々の生物に由来するパルミチ
ン酸（C16）からアラキドン酸（20:4 Δ5，8，11，14）およびステアリドン酸（
18:4 Δ6，9，12，15）の合成のための可能な経路を示す。これらのPUFAは、ヒ
トおよび他の動物に重要な他の分子（プロスタサイクリン、ロイコトリエンおよ
びプロスタグランジンを含み、それらのいくつかが示されている）の前駆体とし
て機能することが可能である。
図２は、種々の生物からまとめた、ARAに加えてEPAおよびDHAを含むPUFAの産
生のための可能な経路を示す。
図3A〜Eは、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼのDNA配列（配列番号1）
および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図４は、Motierella alpinaΔ6-デサチュラーゼアミノ酸と、他のΔ6デサチュ
ラーゼおよび関連配列（配列番号7、8、9、10、11、12および13）とのアライン
メントを示す。
図５A〜Dは、Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼのDNA配列（配列番号
３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図６は、PCR断片の推定アミノ酸配列（配列番号14）を示す(実施例１を参照さ
れたい)。
図７A〜Dは、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのDNA配列（配列番号５
）を示す。
図８は、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのタンパク質配列（配列番
号６）と、Δ6デサチュラーゼおよび関連配列（配列番号15、16、17、18）との
ア
ラインメントを示す。
図９は、Ma29のタンパク質配列およびコンティグ253538aとのアライメントを
示す。
図10は、Ma524のタンパク質配列およびコンティグ253538aとのアライメントを
示す。
配列表の簡単な説明
配列番号１は、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼのDNA配列を示す。
配列番号２は、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼのアミノ酸配列を示
す。
配列番号３は、Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼのDNA配列を示す。
配列番号４は、Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼのアミノ酸配列を示
す。
配列番号５は、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのDNA配列を示す。
配列番号６は、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのアミノ酸配列を示
す。
配列番号7〜13は、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼに関連するアミノ
酸配列を示す。
配列番号14は、実施例１のPCR断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号15〜18は、Mortierella alpina Δ5およびΔ6デサチュラーゼに関連
するアミノ酸配列を示す。
配列番号19〜30は、PCRプライマー配列を示す。
配列番号31〜37は、ヒトヌクレオチド配列を示す。
配列番号38〜44は、ヒトペプチド配列を示す。
配列番号45および配列番号46は、Dictyostelium discoideiumデサチュラーゼ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
配列番号47〜50は、Schizochytrium cDNAクローンのヌクレオチドおよび推定
アミノ酸配列を示す。
好適な実施の形態の説明
本発明の完全な理解を保証するために、以下の定義を記載する。
Δ5-デサチュラーゼ：Δ5デサチュラーゼは、脂肪酸分子のカルボキシル末端
から５番目の炭素（炭素5）と６番目の炭素（炭素6）との間に二重結合を導入す
る酵素である。
Δ6-デサチュラーゼ：Δ6デサチュラーゼは、脂肪酸分子のカルボキシル末端
から６番目の炭素（炭素6）と７番目の炭素（炭素7）との間に二重結合を導入す
る酵素である。
Δ9-デサチュラーゼ：Δ9デサチュラーゼは、脂肪酸分子のカルボキシル末端
から９番目の炭素（炭素9）と10番目の炭素（炭素10）との間に二重結合を導入
する酵素である。
Δ12-デサチュラーゼ：Δ12デサチュラーゼは、脂肪酸分子のカルボキシル末
端から12番目の炭素（炭素12）と13番目の炭素（炭素13）との間に二重結合を導
入する酵素である。
脂肪酸：脂肪酸は、長い炭化水素鎖および末端カルボキシル基を含有する化合
物のクラスである。脂肪酸には、以下のものが含まれる。
これらの定義を考慮した上で、本発明は、植物細胞の多不飽和長鎖脂肪酸含量
の改変を可能にする新規DNA配列、DNA構築物、方法および組成物を提供する。植
物細胞内において１以上のPUFAの量を増加させることができるポリペプチドをコ
ードするDNAを含む発現カセットで、植物細胞を形質転換する。望ましくは、宿
主細胞のゲノムに該発現カセットを組み込む組込みを与えられた構築物を調製し
得る。デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするセンスまたはアン
チセンスDNAを発現するよう、宿主細胞を操作する。「デサチュラーゼ」は、１
以上の脂肪酸を不飽和化して関心のあるモノ-もしくは多-不飽和脂肪酸またはそ
の前駆体を与えうるポリペプチドを意味する。「ポリペプチド」は、長さまたは
翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）とは無関係に、アミノ酸の
任意の鎖を意昧する。発現される酵素の基質は、宿主細胞により産生されるか、
あるいは外因的に供給されることが可能である。
宿主細胞内において発現を達成するために、該形質転換DNAを、該宿主細胞内
で機能的である転写および翻訳の開始および終結調節領域に、機能しうる形で連
結する。発現される遺伝子を含む構築物は、宿主細胞のゲノム内への組込みを引
き起こすことが可能であり、あるいは宿主細胞内で自律複製することが可能であ
る。リノール酸（LA）の産生の場合、一般に使用する発現カセットには、特にオ
レイン酸を産生し又は取込みうる宿主細胞内でΔ12-デサチュラーゼ活性を与え
るカセットが含まれる。ALAの産生の場合、一般に使用する発現カセットには、
特にLAを産生し又は取込みうる宿主細胞内でΔ15−もしくはω3-デサチュラーゼ
活性を与えるカセットが含まれる。GLAまたはSDAの産生の場合、一般に使用する
発現カセットには、特にLAまたはALAをそれぞれ産生し又は取込みうる宿主細胞
内でΔ6-デサチュラーゼ活性を与えるカセットが含まれる。LAやGLAなどのω6型
不飽和脂肪酸の産生は、Δ15またはω3型デサチュラーゼの活性を阻害すること
によりALAを産生することができる植物において行われるのが好ましい。これは
、アンチセンスΔ15またはω3転写産物のための発現カセットを付与することに
より、またはΔ15-またはω3-デサチュラーゼ遺伝子を破壊することにより、達
成される。同様に、LAやALAの産生は、Δ6デサチュラーゼ活性を有する植物内に
おいて、アンチセンスΔ6転写産物のための発現カセットを付与することにより
、またはΔ6-デサチュラーゼ遺伝子を破壊することにより、行われるのが好まし
い。同様に、オレイン酸の産生は、Δ12デサチュラーゼ活性を有する植物内にお
いて、アンチセンスΔ12転写産物のための発現カセットを付与することにより、
またはΔ12-デサチュラーゼ遺伝子を破壊することにより、行われるのが好まし
い。ARAの産生の場合、一般に使用する発現カセットは、特にDGLAを産生し又は
取込みうる宿主細胞内でΔ5-デサチュラーゼ活性を与える。ARAなどのω6型不飽
和脂肪酸の産生は、Δ15またはω3型デサチュラーゼの活性を阻害することによ
りALAを産生することができる植物において行われるのが好ましい。これは、ア
ンチセンスΔ15またはω3転写産物のための発現カセットを付与することにより
、またはΔ15-またはω3-デサチュラーゼ遺伝子を破壊することにより、達成さ
れる。
トランスジェニック植物による脂肪酸の製造
トランスジェニック植物によるPUFAの製造は、魚または植物などの天然起源か
らの精製より優れたいくつかの利点を有する。組換え植物からの脂肪酸の製造
は、宿主内に新たな合成経路を付与することにより、あるいは望ましくない経路
を抑制し、それにより望ましいPUFAまたはそのコンジュゲート化形態のレベルを
増加させ、望ましくないPUFAのレベルを減少させることにより、天然に生じる植
物的脂肪酸プロフィールを改変することが可能となる。また、トランスジェニッ
ク植物における脂肪酸の産生は、特定の組織および／または植物部位におけるデ
サチュラーゼ遺伝子の発現が、これらの組織および／または部位における所望の
PUFAレベルの大幅な増加を達成することができることを意昧し、これらの組織か
らより経済的に回収することができるという利点を提供する。例えば、所望のPU
FAは種子の中で発現することができ、種子油を単離する方法が確立されている。
所望のPUFAを精製するための起源を与えることに加えて、種子油成分を、デサチ
ュラーゼ遺伝子（単独でまたは伸長酵素（elongase）などの他の遺伝子とともに
）の発現を介して操作し、特定のPUFAプロフィールを有する種子油を濃縮した形
で提供することができる。次に、母乳による授乳が不可能または望ましくない場
合、あるいは大人および幼児の両方が栄養失調であるか病気である場合、この濃
縮した種子油を動物のミルクおよび／または合成もしくは半合成ミルクに加えて
乳幼児用配合物として使用することができる。
PUFAの製造には、宿主細胞、基質の利用可能性、および所望の最終産物に応じ
て、いくつかのポリペプチド、特にデサチュラーゼが、ステアリン酸からオレイ
ン酸へ、LAからGLAへ、ALAからSDAへ、オレイン酸からLAへ、またはLAからALAへ
の変換を触媒するポリペプチドを含め、関心が持たれる。これらには、Δ6、Δ9
、Δ12、Δ15またはω3位置で不飽和化する酵素が含まれる。デサチュラーゼ活
性を有する特定のポリペプチドの選択のための考慮事項には、該ポリペプチドの
最適pH該ポリペプチドが律速酵素またはその成分であるか否か、使用するデサチ
ュラーゼが所望の多不飽和脂肪酸および／または該ポリペプチドにより要求され
る補因子の合成に必須であるか否かが含まれる。発現されるポリペプチドは、好
ましくは、宿主細胞におけるその位置の生化学的環境に適合したパラメーターを
有する。例えば、該ポリペプチドは、基質に関して宿主細胞内の他の酵素と競合
する必要があるかもしれない。したがって、所定の宿主細胞内でのPUFA産生を改
変するための所定のポリペプチドの適合性の決定の際には、問題
のポリペプチドのKmおよび比活性の分析を考慮する。したがって、ある特定の状
況において使用するポリペプチドは、意図される宿主細胞内に存在する条件下で
機能しうるものであるが、その他の点では、所望のPUFAの相対的産生を改変しう
る所望の特性を有するデサチュラーゼ活性を有する任意のポリペプチドであるこ
とが可能である。パルミチン酸（C16）からのアラキドン酸（20:4 Δ5、8、11、
14）の合成スキームを、図１に示す。この経路における鍵酵素は、DH-γ-リノレ
ン酸（DGLA、エイコサトリエン酸）をARAに変換するΔ5-デサチュラーゼである
。また、Δ6-デサチュラーゼによるα-リノレン酸（ALA）からステアリドン酸へ
の変換が示されている。ARAに加えてEPAおよびDHAを含むPUFAの産生を、図２に
示す。ステアリン酸（C18）からのアラキドン酸（20：4Δ5、8、11、14）の合成
における鍵酵素は、リノール酸をγリノレン酸に変換するΔ6-デサチュラーゼで
ある。Δ6-デサチュラーゼによるα-リノレン酸（ALA）のステアリドン酸（stea
ridonic acid）への変換も示されている。ARAの製造では、使用されるDNA配列は
、Δ5-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。特定の場合、こ
れは、Δ6-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドの産生を与える発現カセッ
トと、および任意で、Δ15転写産物に対するアンチセンス配列の産生を与える転
写カセットとに、結合することができる。使用されるカセットの組み合わせの選
択は、一部には、宿主細胞のPUFAプロフィールに依存する。宿主細胞のΔ5-デサ
チュラーゼ活性が制限されている場合は、Δ5-デサチュラーゼの過剰発現だけで
、ARA産生を増強するのに十分であろう。
デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドの起源
デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコ
ードするオリゴヌクレオチドの起源は、所望の多不飽和脂肪酸を産生する生物で
ある。一例として、ARAを産生する能力を有する微生物を、Δ5-デサチュラーゼ
遺伝子の起源として使用することができる(GLAまたはSDAがΔ6-デサチュラーゼ
および／またはΔ12-デサチュラーゼ遺伝子の起源として使用することができる
微生物)。そのような微生物には、例えば、Mortierella、Conidiobolus、Pythiu
m、Phytophathora、Penicillium、Porphyridium、Coidosporium、Mucor、
Fusarium、Aspergillus、RhodotorulaおよびEntomophthora属に属する微生物が
含まれる。Porphyridium属のなかで特に関心が持たれるのは、Porphyridium cru
entumである。Mortierella属のなかで特に関心が持たれるのは、Mortierella el
ongata、Mortierella exigua、Mortierella hygrophila、Mortierella ramannia
na、var．angulisporaおよびMortierella alpinaである。Mucor属のなかで特に
関心が持たれるのは、Mucor cinelloidesおよびMucor javanicusである。
所望のデサチュラーゼをコードするDNAは、種々の方法で同定することができ
る。一例として、所望のデサチュラーゼの起源、例えば、Mortierella由来のゲ
ノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを、酵素的または化学的に合成された
検出可能なプローブ（これは、DNA、RNAまたは非天然に存在するヌクレオチドま
たはそれらの混合物から作製することができる）でスクリーニングする。通常の
又は減少したストリンジェンシーのハイブリダイゼーション法のためには、プロ
ーブを、公知のデサチュラーゼのDNAから酵素的に合成することができる。また
、オリゴヌクレオチドプローブは、起源をスクリーニングするために使用するこ
とが可能であり、公知デサチュラーゼ間で保存された配列を含む公知デサチュラ
ーゼの配列、または所望の精製タンパク質から得たペプチド配列に基づくことが
可能である。アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブは、遺伝暗号の
縮重を含むように縮重していることが可能であり、あるいは起源生物の好ましい
コドンを優先するよう偏っていることが可能である。また、オリゴヌクレオチド
は、公知の又は疑わしい起源からの逆転写mRNAからのPCRのためのプライマーと
して使用することができ、該PCR産物は、完全長cDNAであることが可能であり、
あるいは所望の完全長cDNAを得るためのプローブを作製するために使用すること
が可能である。別法として、所望のタンパク質を、完全に配列決定し、そのポリ
ペプチドをコードするDNAの全合成を行なうことができる。
所望のゲノムまたはcDNAを単離したら、それを公知方法により配列決定するこ
とができる。当技術分野においては、そのような方法は過誤を受けやすいと認識
されており、そのため同一領域の多重配列決定が常套手段となっているが、それ
でもなお、反復ドメイン、広範な二次構造または異常な塩基組成を有する領域
（例えば、高いGC塩基含量を有する領域）においては特に、得られる推定配列内
の無視できない過誤率を招くと予想される。相違が生じる場合には、再び配列決
定を行なうことができ、特別な方法を用いることができる。特別な方法には、異
なる温度；異なる酵素；より高次の構造を形成するオリゴヌクレオチドの能力を
改変するタンパク質；改変ヌクレオチド、例えばITPまたはメチル化dGTP；異な
るゲル組成、例えば、ホルムアルデヒドの添加；異なるプライマーまたは問題の
領域から異なる距離に位置するプライマー：または異なる鋳型、例えば一本鎖DN
Aを用いることによる配列決定条件の改変を含めることができる。また、mRNAの
配列決定を用いることができる。
通例、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配列の一部または全
部は、天然由来である。しかしながら、場合によっては、例えば、宿主に好まし
いコドンを用いることにより発現を増強するために、コドンの全部または一部を
改変することが望ましい。宿主に好ましいコドンは、関心のある特定の宿主種に
おいて最大量で発現されるタンパク質における最高頻度のコドンから決定するこ
とができる。したがって、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配
列の全部または一部を合成することができる。また、転写されるmRNA中に存在す
る任意の不安定化配列または二次構造の領域を除去するよう、該DNAの全部また
は一部を合成することができる。また、塩基組成を、所望の宿主細胞において更
に好ましいものに改変するために、該DNAの全部または一部を合成することがで
きる。配列を合成し配列を合体させるための方法は、文献において十分に確立さ
れている。所望の多不飽和脂肪酸のより長い半減期またはより高い産生速度など
の宿主細胞における機能に関するより望ましい物理的および速度論的パラメータ
ーを有するin vivoデサチュラーゼ活性を有するポリペプチドが産生されるよう
に天然に存在するデサチュラーゼ遺伝子の突然変異を得るために、in vitro突然
変異誘発および選択、部位特異的突然変異誘発または他の手段を用いることがで
きる。
望ましいcDNAは、60％未満のA+T組成、好ましくは50％未満のA+T組成を有する
。20塩基対のスライディングウィンドウの局在化スケールでは、75％未満のA+T
組成を有するcDNAの局所化領域がないことが好ましく、60塩基対のウィ
ンドウでは、60％を超えるA+T組成を有するcDNAの局在化領域がないことが好ま
しく、55％を超えるA+T組成を有するcDNAの局在化領域がないことがより好まし
い。
Mortierella alpinaデサチュラーゼ
特に関心が持たれるのは、Mortierella alpinaのΔ5-デサチュラーゼ、Δ6-デ
サチュラーゼおよびΔ12-デサチュラーゼである。Δ5-デサチュラーゼは446アミ
ノ酸を有し、このアミノ酸配列は図７に示される。DGLAからARAのより著しい合
成を達成するために、Mortierella alpinaのΔ5-デサチュラーゼをコードする遺
伝子をトランスジェニック微生物内で発現させることができる。また、Mortiere
lla alpina Δ5-デサチュラーゼDNAと配列が実質的に同一であるか、またはMort
ierella alpina Δ5-デサチュラーゼポリペプチドと配列が実質的に同一である
ポリペプチドをコードする他のDNAを使用することもできる。Mortierella alpin
a Δ6-デサチュラーゼは、457アミノ酸および51.8kDの推定分子量を有し、その
アミノ酸配列は、図３に示される。リノール酸からGLA、またはALAからステアリ
ドン酸（SDA）の、より著しい合成を達成するために、Mortierella alpinaのΔ6
-デサチュラーゼをコードする遺伝子をトランスジェニック植物または動物内で
発現させることができる。また、Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼDNAと
配列が実質的に同一であるか、またはMortierella alpina Δ6-デサチュラーゼ
ポリペプチドと配列が実質的に同一であるポリペプチドをコードする他のDNAを
使用することもできる。
Mortierella alpina Δ12-デサチュラーゼは、図５に示されたアミノ酸配列を
有する。オレイン酸からLAのより著しい合成を達成するために、Mortierella al
pinaのΔ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子をトランスジェニック植物内で
発現させることができる。また、Mortierella alpina Δ12−デサチュラーゼDNA
と実質的に同一であるか、またはMortierella alpina Δ12-デサチュラーゼポリ
ペプチドと実質的に同一であるポリペプチドをコードする他のDNAを使用するこ
ともできる。
配列が実質的に同一は、Mortierella alpina Δ5-デサチュラーゼのアミノ酸
配列または該アミノ酸配列をコードする核酸配列に対して少なくとも60％、80％
、90％または95％（この順序で好ましさが増加する）の相同性を示すアミノ酸配
列または核酸配列を意味する。ポリペプチドの場合には、比較配列の長さは、一
般には少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸、最も好ましく
は35アミノ酸である。核酸の場合には、比較配列の長さは、一般には少なくとも
50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なく
とも75ヌクレオチド、最も好ましくは110ヌクレオチドである。相同性は、典型
的には、配列分析ソフトウェア、例えばGenetics Computer Group，University
of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wisc
onsin 53705，MEGAlign（DNAStar，Inc.，1228 S．Park St.，Madison，Wiscons
in 53715）およびMacVector（Oxford Molecular Group，2105 S．Bascom Avenue
，Suite 200，Campbell，California 95008）のSequence Analysisソフトウェア
パッケージを使用して測定する。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失
および他の修飾に対する相同性の度合を当てはめることにより同様の配列同士を
突き合わせる。保存的置換には、典型的には、以下の基の範囲内での置換が含ま
れる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオ
ニン；リシンおよびアルギニン；およびフェニルアラニンおよびチロシン。また
、置換は、保存された疎水性または親水性に基づいて（KyteおよびDoolittle，J
．Mol．Biol．157:105-132，1982）あるいは同様のポリペプチド二次構造をとる
能力に基づいて（ChouおよびFasman，Adv．Enzymol．47:45−148，1978）行なう
ことが可能である。
他のデサチュラーゼ
本発明には、同じまたは他の生物に由来する関連デサチュラーゼが含まれる。
そのような関連デサチュラーゼには、Mortierellの同じまたは異なる種内の天然
に存在する開示されているΔ5-、Δ6-およびΔ12-デサチュラーゼ変異体、なら
びに他の種に由来する開示されているΔ5-デサチュラーゼの相同体、およびデサ
チュラーゼ活性を有する進化上関連するタンパク質が含まれる。また、
Mortierella alpinaΔ5-デサチュラーゼと実質的に同一ではないが、脂肪酸分子
のカルボキシル末端からそれぞれ５番目、６番目または12番目の炭素において脂
肪酸分子を不飽和化するデサチュラーゼも含まれる。関連デサチュラーゼは、開
示されているデサチュラーゼと実質的に同様に機能するそれらの能力（すなわち
、依然としてDGLAをARAに、LAをGLAに、またはオレイン酸をLAに有効に変換する
能力）により同定することができる。また、開示されているデサチュラーゼに基
づくプローブを、起源生物から構築されたライブラリーにハイブリダイズさせる
ことにより、あるいは起源生物に由来するmRNAおよび開示されているデサチュラ
ーゼに基づくプライマーを使用するRT-PCRにより、開示されているデサチュラー
ゼに相同な配列に関して配列データベースをスクリーニングすることによっても
関連デサチュラーゼを同定することができる。そのようなデサチュラーゼには、
ヒト、Dictyostelium discoideumおよびPhaeodactylum tricornumに由来するも
のが含まれる。
デサチュラーゼ活性に重要なデサチュラーゼポリペプチドの領域は、通常の突
然変異誘発、生じる突然変異ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の測定に
より決定することができる。突然変異体には、欠失、挿入および点突然変異また
はそれらの組合せを含めることができる。典型的な機能分析は、欠失突然変異誘
発から開始して、機能に必要なタンパク質のNおよびC末端境界を決定し、ついで
内部欠失、挿入または点突然変異体を作製して、機能に必要な領域を更に決定す
る。また、カセット突然変異誘発または全合成などの他の技術を用いることもで
きる。例えば、5'または3'コード領域を順次除去するためにエキソヌクレアーゼ
を使用することにより、欠失突然変異誘発を行なう。そのような技術のためのキ
ットが入手可能である。欠失後、開始または停止コドンを含有するオリゴヌクレ
オチドを、それぞれ5'または3'の欠失の後に該欠失コード領域に連結することに
より、該コード領域は完成する。別法として、開始または停止コドンをコードす
るオリゴヌクレオチドを、部位特異的突然変異誘発、突然変異PCRなどの種々の
方法により、あるいは既存の制限部位で消化されたDNAに対する連結により、該
コード領域に挿入する。内部欠失は、部位特異的突然変異誘発または突然変異原
性PCRを介した突然変異原性プライマーの使用による、DNA内の既存の制限部
位の使用などの種々の方法により、同様に作製することができる。挿入は、リン
カースキャニング突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発または突然変異原性PC
Rなどの方法により作製する。点突然変異は、部位特異的突然変異誘発または突
然変異原性PCRなどの技術により作製する。
また、活性に重要なデサチュラーゼポリペプチドの領域を同定するために、化
学突然変異誘発を用いることができる。突然変異構築物を発現させ、得られた改
変タンパク質がデサチュラーゼとして機能する能力をアッセイする。そのような
構造−機能分析により、どの領域を欠失させることが可能か、どの領域が挿入を
許容するか、およびどの点突然変異が、該突然変異タンパク質が天然デサチュラ
ーゼと実質的に同様に機能するのを可能にするのかを判定することができる。そ
のようなすべての突然変異タンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列
は、本発明の範囲内である。
デサチュラーゼ遺伝子の発現
デサチュラーゼポリペプチドをコードするDNAが得られたら、それを宿主細胞
内で複製可能なベクター内に配置し、あるいはそのようなPCRまたはロング（lon
g）PCRなどの技術によりin vitroで増殖させる。複製ベクターには、プラスミド
、ファージ、ウイルス、コスミドなどを含めることができる。望ましいベクター
には、関心のある遺伝子の突然変異誘発に又は宿主細胞内での関心のある遺伝子
の発現に有用なものが含まれる。ロングPCRの技術は、大きな構築物のin vitro
増殖を可能にし、その結果、関心のある遺伝子に対する修飾、例えば、突然変異
誘発または発現シグナルの付加、および得られた構築物の増殖を、複製ベクター
または宿主細胞を使用することなく、完全にin vitroで行なうことができる。
デサチュラーゼポリペプチドの発現のために、機能的な転写および翻訳の開始
および終結領域を、デサチュラーゼポリペプチドをコードするDNAに、機能しう
る形で連結させる。転写および翻訳の開始および終結領域は、発現させるDNA、
所望の系内での発現が可能であることが公知の又は疑わしい遺伝子、発現ベクタ
ー、化学合成などの種々の非排他的起源に由来するか、または宿主細胞内の内因
性遺伝子座に由来する。植物組織および／または植物部位における発現は、特に
、該組織または部位が簡単に収穫できるもの、例えば種子、葉、果実、花、根な
どである場合、一定の効率を示す。発現は、特定の制御配列（例えば米国特許第
5,463,174号、米国特許第4,943,674号、米国特許第5,106,739号、米国特許第5,1
75,095号、米国特許第5,420,034号、米国特許第5,188,958号および米国特許第5,
589,397号のものなど）を用いて植物内のその位置にターゲッティングすること
ができる。あるいは、発現されるタンパク質は、宿主植物からの液体画分の中に
直接もしくはさらなる修飾により取りこまれうる産物を生成する酵素であること
ができる。本件では、デサチュラーゼ遺伝子の発現、またはアンチセンスデサチ
ュラーゼの転写により、植物部位および／または植物組織内に見られる特定のPU
FA、またはその誘導体のレベルを改変することができる。Δ5-デサチュラーゼポ
リペプチドのコード領域は、より高い割合の所望のPUFAを含む組織および／また
は植物部位を生成するために、単独でもしくは他の遺伝子とともに発現する。ま
たは、この場合PUFA組成はヒト母乳のそれに非常に似通っている(Prietoら、PCT
公開WO95/24494)。終結領域は、開始領域が由来する起源から得られた遺伝子の3
'側領域から得られたものでもよいし、異なる遺伝子から得られたものであって
もよい。多くの終結領域が知られており、同じまたは異なる属および種からの種
々の宿主において申し分ないものであることが分かっている。終結領域は通常、
任意の特定の特性によるというよりは、簡便さの問題で選択される。
宿主細胞の選択は、トランスジェニック細胞の所望のPUFAプロフィール、およ
び宿主細胞の天然プロフィールにより部分的に影響を受ける。１例として、オレ
イン酸からリノール酸を製造する場合、使用するDNA配列はΔ12デサチュラーゼ
活性を有するポリペプチドをコードし、リノール酸からGLAを製造する場合、使
用するDNA配列はΔ6-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
Δ12デサチュラーゼ活性を発現し且つΔ15デサチュラーゼ活性が欠如または枯渇
している宿主細胞の使用は、Δ6デサチュラーゼのみを過剰発現する発現カセッ
トとともに使用することができ、この使用はトランスジェニック細胞内でのGLA
の産生を増加させるのに十分である。宿主細胞がΔ9デサチュラーゼ活性を
発現する場合、Δ12-およびΔ6-デサチュラーゼ両方を発現させることにより、G
LA産生を増強させることができる。特にΔ6-デサチュラーゼ活性の発現がΔ12デ
サチュラーゼ活性の発現と組み合わさった場合、宿主細胞は低Δ15デサチュラー
ゼ活性を天然に有するかまたはそのように突然変異させられることが望ましい。
あるいは、Δ6-デサチュラーゼ発現のための宿主細胞は、高Δ12デサチュラーゼ
活性を天然に有するかまたはそのように突然変異させられてもよい。
宿主細胞内での発現は、一過性または安定に達成することができる。一過性発
現は、宿主細胞内で機能的である発現シグナルを含有する導入された構築物（し
かしながら、この構築物は複製されず、めったに宿主細胞内に組込まれないか又
は該宿主細胞は増殖性でない）から生じることが可能である。また、関心のある
遺伝子に機能しうる形で連結された調節可能なプロモーターの活性を導入するこ
とにより、一過性発現を達成することができる(ただし、そのような誘導系は、
低い基底レベルの発現を示すことが多い)。安定発現は、宿主ゲノム内に組込ま
れうる又は宿主細胞内で自律複製する構築物の導入により達成することができる
。関心のある遺伝子の安定発現は、該発現構築物上に位置するか又は該発現構築
物でトランスフェクトされた選択マーカーの使用により選択し、ついで該マーカ
ーを発現する細胞に関して選択することができる。安定発現が組込みから生じる
場合には、構築物の組込みは、宿主ゲノム内でランダムに生じることが可能であ
り、あるいは宿主遺伝子座との組換えを標的化するのに十分な程度に宿主ゲノム
に相同な領域を含有する構築物の使用により標的化されることが可能である。構
築物を内因性遺伝子座に標的化する場合には、該転写および翻訳調節領域の全部
または一部は、該内因性遺伝子座により付与されることが可能である。
起源植物内でのデサチュラーゼポリペプチドの発現の増加が望ましい場合には
、いくつかの方法を用いることができる。デサチュラーゼポリペプチドをコード
する追加的遺伝子を、宿主生物内に導入することができる。また、天然デサチュ
ラーゼ遺伝子座からの発現は、例えば、より強力なプロモーターを宿主ゲノム内
に挿入して発現の増強を引き起こすことにより、あるいは不安定化配列を、その
情報を該宿主ゲノムから欠失させて該mRNAまたは該コード化タンパク質から除去
することにより、あるいは該mRNAに安定化配列を付加することにより、相同組
換えを介して増加させることができる(米国特許第5,500,365号を参照のこと)。
異なる２以上の遺伝子、適当な調節領域および発現方法を発現させることが望
ましい場合には、導入された遺伝子を、複製ベクターの使用により又は宿主ゲノ
ム内への組込みにより、宿主細胞内で増殖させることができる。別々の複製ベク
ターから２以上の遺伝子を発現させる場合には、各ベクターが、異なる複製手段
を有することが望ましい。安定発現を維持し、構築物間の要素の再構築を妨げる
ために、導入された各構築物は、組込まれているか否かにかかわらず、異なる選
択手段を有すべきであり、その他の構築物に対する相同性を欠くべきである。調
節領域、選択手段および導入構築物の増殖方法の賢明な選択は、すべての導入遺
伝子が必要なレベルで発現されて所望の産物の合成がもたらされるよう、実験的
に決定することができる。
関心のある遺伝子を含む構築物は、標準的な技術により宿主細胞内に導入する
ことができる。これらの技術には、トランスフェクション、感染、ボリスチック
（bolistic）衝撃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、擦り
取り、または関心のある遺伝子を宿主細胞内に導入する他の任意の方法が含まれ
る(米国特許第4,743,548号、米国特許第4,795,855号、米国特許第5,068,193号、
米国特許第5,188,958号、米国特許第5,463,174号、米国特許第5,565,346号およ
び米国特許第5,565,347号を参照のこと)。便宜上、DNA配列または構築物を取込
ませる任意の方法により操作されている宿主細胞を、本発明では、「形質転換（
された）」または「組換え（体）」と称することにする。対象宿主は、少なくと
も１コピーの発現構築物を有し、また、該遺伝子がゲノム内に組込まれるか、増
幅されるか、または多コピー数を有する染色体外要素上に存在するかに応じて、
２以上のコピーを有することが可能である。
形質転換された宿主細胞は、導入した構築物上に含まれるマーカーに関する選
択により同定することができる。あるいは、多数の形質転換技術が宿主細胞内に
多数のDNA分子を導入するため、分離したマーカー構築物を所望の構築物と共に
導入することができる。典型的には、形質転換された宿主は、それが選択培地上
で増殖する能力に関して選択される。選択培地は、抗生物質を含んでいたり、あ
るいは未形質転換宿主の増殖に必要な因子（例えば、栄養因子または増殖因子）
を欠いていてもよい。そのための導入マーカー遺伝子は、抗生物質耐性を付与し
、あるいは必須の増殖因子または酵素をコードし、形質転換宿主内で発現された
場合に選択培地上での増殖を可能にしうる。望ましくは、カナマイシンにおよび
アミノグリコシドG418に対する耐性に関心が持たれる(米国特許第5,034,322号を
参照のこと)。また、形質転換宿主の選択は、発現されたマーカータンパク質が
直接的または間接的に検出可能な場合に行なうことができる。該マーカータンパ
ク質は、単独で又は別のタンパク質との融合体として発現させることができる。
該マーカータンパク質は、その酵素活性により検出することができ、例えば、β
ガラクトシダーゼは基質X-galを着色産物に変換することが可能であり、ルシフ
ェラーゼはルシフェリンを発光性産物に変換することが可能である。該マーカー
タンパク質は、その光生成または修飾特性により検出することができ、例えば、
発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）のグリーン蛍光タンパク質は、青色光
が照射されると蛍光を発する。該マーカータンパク質または分子タグ（例えば、
関心のあるタンパク質上のもの）を検出するために、抗体を使用することができ
る。該マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば、視覚的に、ま
たはFACSまたは抗体を使用するパンニングなどの技術により選択することができ
る。
本発明の方法および組成物を用いて産生されるPUFAは、遊離脂肪酸として又は
アシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質などの複合形態で、宿主植
物の組織および／または植物部位おいて見出されることがあり、当技術分野で良
く知られている種々の手段により宿主細胞から抽出することができる。そのよう
な手段には、有機溶媒での抽出、音波処理、例えば二酸化炭素を使用する超臨界
流体抽出、および圧搾などの物理的手段、またはそれらの組合せを含めることが
できる。特に関心が持たれるのは、ヘキサンまたはメタノールおよびクロロホル
ムでの抽出である。所望により、負に荷電した部分をプロトン化し、それにより
有機層中への所望の産物の分配を増加させるために、水層を酸性化することがで
きる。抽出後、窒素気流下での蒸発により有機層を除去することができる。該産
物がコンジュゲート化形態で単離される場合には、該遊離脂肪酸または関心のあ
るそれほど複雑でないコンジュゲートを放出するために、該産物を酵素的また
は化学的に切断することができ、ついで所望の最終産物を得るために更なる操作
に付すことができる。望ましくは、コンジュゲート化形態の脂肪酸を水酸化カリ
ウムで切断する。
脂肪酸の精製
更なる精製が必要な場合には、標準的な方法を用いることができる。そのよう
な方法には、抽出、尿素での処理、分別晶出、HPLC、分別蒸留、シリカゲルクロ
マトグラフィー、高速遠心分離もしくは蒸留、またはこれらの技術の組合せを含
めることができる。酸またはアルケニル基などの反応性基の保護を、公知技術、
例えばアルキル化またはヨウ素化により、任意の工程で行なうことができる。用
いる方法には、メチルエステルを得るための脂肪酸のメチル化が含まれる。同様
に、任意の工程で保護基を除去することができる。望ましくは、ARA、DHAおよび
EPAを含有する画分の精製は、尿素での処理および／または分別蒸留により行わ
れる。
脂肪酸の用途
本発明の脂肪酸には、いくつかの用途がある。本発明のDNAに基づくプローブ
は、関連分子の単離方法またはデサチュラーゼを発現する生物の検出方法におい
て有用である。該DNAまたはオリゴヌクレオチドは、プローブとして使用される
場合には、検出可能である必要がある。これは、通常、例えば修飾された残基の
取込みにより内部部位に又は5'もしくは3'末端に標識を付けることにより達成さ
れる。そのような標識は、直接検出することができるものであってもよく、ある
いは検出可能なように標識された二次分子に結合することが可能であり、あるい
は未標識二次分子および検出可能なように標識された三次分子に結合することが
可能であり、この方法は、許容できないレベルのバックグラウンドシグナルを伴
うことなく満足に検出可能なシグナルを得るのに実用的である限り、拡張適用す
ることができる。二次、三次または架橋系には、他の任意の分子（標識または他
の抗体を含む）に対する抗体の使用を含めることが可能であり、あるいは互いに
結合する任意の分子、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン/アビジン系を含め
ることが可能である。典型的には、検出可能な標識には、放射性同位体、化学的
または酵素的に光を生成または改変する分子、検出可能な反応産物を与える酵素
、磁性分子、蛍光分子または結合に際して変化する蛍光または光放出特性を有す
る分子が含まれる。標識方法の具体例は、米国特許第5,011,770号に記載されて
いる。あるいは、標的分子の結合は、標的に対するプローブの結合の際の溶解熱
の変化を等温滴定熱量測定により測定することにより、あるいは表面上の該プロ
ーブまたは標的をコートしそれぞれ標的またはプローブの結合により生じる表面
からの光の散乱の変化を検出することにより(例えば、BIAcore系で行なうことが
できる)、直接検出することができる。
組換え手段により産生する本発明のPUFAは、多種多様な領域において有用であ
る。ヒトまたは動物を種々の形態のPUFAで補うと、添加したPUFAのレベルだけで
なく、それらの下流代謝産物のレベルも増加しうる。例えば、固有のΔ6-デサチ
ュラーゼ経路が個体において機能不全である場合、GLAによる治療は、GLAのレベ
ルだけでなく、ARAやプロスタグランジンなどの下流産物（図１を参照されたい
）のレベルも増加させうる。複合的な調節メカニズムは、種々のPUFAを組合せる
こと又はPUFAの種々のコンジュゲートを加えることが、そのようなメカニズムを
阻害、制御または抑制して個体において所望のレベルの特異的PUFAを得るために
望ましいものとしうる。
開示している方法により製造したPUFAまたはその誘導体は、食物代用物または
補充剤（特に、乳幼児用配合物）として、あるいは静脈内栄養補給を受けている
患者のために、あるいは栄養失調を予防または治療するために使用することがで
きる。EPAなどの特定の脂肪酸は、ヒトの母乳のPUFA組成をより良く再現するよ
うに乳幼児用配合物の組成を改変するために使用することができる。ヒトの母乳
中の優勢なトリグリセリドは、1,3-ジ-オレオイル-2-パルミトイルであると報告
されており、2-パルミトイルグリセリドは2-オレオイルまたは2-リネオイルグリ
セリドより良く吸収されると報告されている(米国特許第4,876,107号)。典型的
には、ヒトの母乳は、DHAとして約0.15％〜約0.36％、EPAとして約0.03％〜約0.
13％、ARAとして約0.30％〜約0.88％、DGLAとして約0.22％〜約0.67％、およびG
LAを約0.27％〜約1.04を含む脂肪酸プロフィールを有する。
乳幼児用配合物のGLA：DGLA：ARAの好適な比は、それぞれ約1：1：4〜約1：1：1
である。これらのPUFA比を与える油の量は、当業者により過度の実験を行うこと
なく決定することができる。また、動物の組織または乳の脂肪酸組成をヒトまた
は動物の消費に一層好ましいものに改変するために、PUFAまたはそれを含有する
宿主細胞を動物用食物補充剤として使用することができる。
栄養組成物
本発明はまた、栄養組成物を含む。そのような組成物は、本発明の目的におい
ては、体内に摂取されると、(a)組織を養育もしくは構成し又はエネルギーを供
給するよう機能し、および／または、(b)適当な栄養状態または代謝機能を維持
し、回復し又は支持する、ヒトが消費する任意の食物または調製物（経腸的また
は非経口的消費のためのものを含む）を含む。
本発明の栄養組成物は、本発明に従い製造された少なくとも１つの油または酸
を含み、固体または液体のいずれの形態であってもよい。また、該組成物は、個
々の用途に望ましい量の食用の多量栄養素、ビタミンおよびミネラルを含むこと
が可能である。そのような成分の量は、該組成物が、特別な必要性、例えば、あ
る代謝状態（例えば、代謝障害）に伴う必要性を有する健常な乳幼児、小児また
は成人への使用が意図されるか否かに応じて異なるであろう。
該組成物に加えることができる多量栄養素には、例えば、食用脂肪、炭水化物
およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような
食用脂肪には、例えば、ヤシ油、大豆油ならびにモノおよびジグリセリドが含ま
れるが、これらに限定されるものではない。そのような炭水化物には、例えば、
グルコース、食用ラクトースおよび加水分解デンプン（hydrolyzed search）が
含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の栄養組成物中
で使用することができるタンパク質には、例えば、大豆タンパク質、電気透析さ
れたホエー、電気透析された脱脂乳、乳ホエー、またはこれらのタンパク質の加
水分解物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ビタミンおよびミネラルに関しては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウ
ム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素ならびに
ビタミンA、E、D、CおよびＢ複合体を、本発明の栄養組成物に加えることができ
る。また、そのような他のビタミンおよびミネラルも加えることができる。
本発明の栄養組成物中で使用する成分は、半精製物または精製物に由来する。
半精製（物）または精製（物）は、天然物の精製により又は合成により調製され
た物質を意味する。
本発明の栄養組成物には、例えば、乳幼児用配合物、食物補充剤および再水和
組成物が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に関心が持たれる栄
養組成物には、乳幼児に対する経腸的および非経口的な補充に使用するもの、専
門的（specialist）乳幼児用配合物、中高年者に対する補充剤、および胃腸障害
および／または吸収不良の者に対する補充剤が含まれるが、これらに限定される
ものではない。
栄養組成物
本発明の典型的な栄養組成物は、個々の用途に望ましい量の食用の多量栄養素
、ビタミンおよびミネラルを含有する。そのような成分の量は、該配合物が、一
時的にストレスにさらされた健常な個体への使用が意図されるのか、または或る
慢性もしくは急性病態（例えば、代謝障害）による特別な必要性を有する被験者
への使用が意図されるのかに応じて異なるであろう。本発明の栄養配合物に使用
する成分は半精製物または精製物に由来する、と当業者には理解されるであろう
。半精製（物）または精製（物）は、天然物の精製により又は合成により調製さ
れた物質を意味する。これらの技術は当技術分野で良く知られている(例えば、C
ode of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing;Reco
mmended Dietary Allowance，第10版，National Academy Press，Washington，D
.C.，1989を参照されたい)。
好ましい実施形態では、本発明の栄養配合物は、経腸栄養製品、より好ましく
は、成人または小児用の経腸栄養製品である。したがって、本発明の更にもう１
つの態様では、ストレスを受けている栄養補給される成人または子供に適した栄
養配合物を提供する。該配合物は、本発明のPUFAに加えて、成人の１日栄養必要
量を与えるよう意図された量の多量栄養素、ビタミンおよびミネラルを含む。
該多量栄養素成分には、食用脂肪、炭水化物およびタンパク質が含まれる。代
表的な食用脂肪としては、ヤシ油、大豆油、およびモノおよびジグリセリド、お
よび本発明のPUFA油が挙げられる。代表的な炭水化物には、グルコース、食用ラ
クトースおよび加水分解コーンスターチが挙げられる。典型的なタンパク質源は
、大豆タンパク質、電気透析されたホエーまたは電気透析された脱脂乳または乳
ホエー、またはこれらのタンパク質の加水分解物であるが、他のタンパク質源も
入手可能であり、使用することができる。これらの多量栄養素は、ヒトの母乳中
に存在するものと同等の量またはエネルギー基準、すなわち毎カロリー基準（pe
r calorie basis）の一般に許容される栄養化合物の形態で加える。
液状経腸栄養配合物を製剤化するための方法は、当技術分野で良く知られてお
り、実施例に詳細に記載されている。
該経腸配合物を滅菌し、ついで、そのまま摂取できる状態（ready-to-feed(RT
F)）で使用したり、あるいは濃縮液または粉末として保存することができる。該
粉末は、前記のとおりに調製した経腸配合物を噴霧乾燥することにより調製する
ことができ、該配合物は、該濃縮物を再水和させることにより再構成することが
できる。成人および乳幼児用の栄養配合物は、当技術分野で良く知られており、
商業的に入手可能である（例えば、Ross Products Division，Abbott
油または酸は、後記の量で、これらの配合物のいずれかに加えることができる。
液体形態の該栄養組成物のエネルギー密度は、典型的には、約0.6Kca〜3Kcal/
mlとなることが可能である。固体または粉末形態の場合には、該栄養補充剤は、
約1.2〜9Kcal/gm以上、好ましくは3〜7Kcal/グラムを含有することが可能である
。一般には、液状産物の浸透圧重量モル濃度は、700mOsm未満、より好ましくは6
60mOsm未満となるべきである。
該栄養配合物は、典型的には、本発明のPUFAに加えて、ビタミンおよびミネラ
ルを含み、これらの物質の最少１日必要量を個体が摂取するのを補助するように
意図されている。また、前記のPUFAに加えて、抗酸化剤の他に亜鉛、銅および葉
酸を該栄養組成物に補充することが望ましいかもしれない。これらの物質はまた
、ストレスを受けた免疫系に追加刺激を与え、それにより該個体に更なる利
点を与えると考えられる。免疫抑制に対する有益な効果を得るためには、亜鉛、
銅または葉酸の存在は任意であり、必ずしも要求されるものではない。同様に、
医薬組成物にも、これらの同じ物質を補充することができる。
より好ましい実施形態では、該栄養剤は、抗酸化系およびPUFA成分に加えて、
炭水化物源を含有し、該炭水化物の少なくとも５重量％は、消化不良性オリゴ糖
である。より一層好ましい実施形態では、該栄養組成物は更に、タンパク質、タ
ウリンおよびカルニチンを含有する。
開示している方法により製造したPUFAまたはその誘導体は、代用食または補充
剤（特に、乳幼児用配合物）として、あるいは静脈内栄養補給を受けている患者
のために、あるいは栄養失調を予防または治療するために使用することができる
。典型的には、ヒトの母乳は、DHAとして約0.15％〜約0.36％、EPAとして約0.03
％〜約0.13％、ARAとして約0.30％〜約0.88％、DGLAとして約0.22％〜約0.67％
、およびGLAを約0.27％〜約1.04を含む脂肪酸プロフィールを有する。さらに、
ヒトの母乳中の優勢なトリグリセリドは、1,3-ジ-オレオイル-2-パルミトイルで
あると報告されており、2-パルミトイルグリセリドは2-オレオイルまたは2-リネ
オイルグリセリドより良く吸収されると報告されている(米国特許第4,876,107号
)。したがって、本発明により製造されるARA、DGLA、GLAおよび／またはEPAなど
の脂肪酸は、ヒトの母乳のPUFA組成をより良く再現するように乳幼児用配合物の
組成を改変するために使用することができる。特に、薬理学的または食用補充剤
（特に、母乳代替物または補充剤）中に使用するための油組成物は、好ましくは
、１以上のARA、DGLAおよびGLAを含む。より好ましくは、該油は、約0.3〜30％
のARA、約0.2〜30％のDGLAおよび約0.2〜約30％のGLAを含む。
濃度に加えて、ARA、DGLAおよびGLAの比率は、与えられた個々の最終用途に適
合させることができる。ARA、DGLAおよびGLAの２以上を含有する油組成物は、母
乳補充剤または代用物として製剤化される場合、それぞれ約１：19：30〜約6：1
：0.2の比で提供される。例えば、動物の母乳のARA：DGLA：DGLの比は、好まし
くは約1：1：1、1：2：1、1：1：4の中間比を含む1：19：30〜6：1：0.2の範囲
の様々な比となりうる。宿主細胞内で一緒に産生される場合には、
PUFAの比を厳密に制御するために、GLAおよびDGLAなどの前駆体基質からARAへの
変換の比率および割合を調節することができる。例えば、ARA対DGLAの比約1：19
を得るためには、DGLAからARAへの変換比率5％〜10％を用い、一方、ARA対DGLA
の比約6：1を得るためには、変換比率約75％〜80％を用いることができる。した
がって、細胞培養系中であるか又は宿主動物中であるかにかかわらず、PUFAのレ
ベルおよび比率をモジュレートするために、記載されているデサチュラーゼの発
現の時期、程度および特異性の調節を行なうことができる。また、用いる発現系
（例えば、細胞培養、または乳中に油を発現する動物）に応じて、該油を単離し
、所望の濃度および比で組換えることができる。これらのPUFA比を与える油の量
は、標準的なプロトコールに従い測定することができる。また、動物の組織また
は乳の脂肪酸組成をヒトまたは動物の消費に一層好ましいものに改変するために
、PUFAまたはそれを含有する宿主細胞を動物用食物補充剤として使用することが
できる。
食物補充のためには、精製されたPUFAまたはその誘導体を、通常用途において
摂取者が所望の量を摂取するように製剤化された調理用油、脂肪またはマーガリ
ン中に加えることができる。また、該PUFAは、乳幼児用配合物、栄養補充剤また
は他の食品中に加えることができ、抗炎症剤およびコレステロール低下剤として
有用かもしれない。
医薬組成物
本発明は、本明細書に記載した方法によって製造された１種またはそれ以上の
酸及び／または生成される油を含む医薬組成物も包含する。より具体的には、こ
のような医薬組成物は、１種またはそれ以上の酸及び／または油とともに、標準
的な周知の無毒の医薬上許容される担体、補助剤、あるいは例えばリン酸緩衝食
塩水、水、メタノール、ポリオール、植物性油、湿潤剤または水／油エマルジョ
ン等のエマルジョのようなビヒクルを含むものとすることができる。組成物は、
液体あるいは固体の形態とすることができる。例えば、前記組成物は、錠剤、カ
プセル剤、経口摂取可能な液剤または粉末剤、注射可能なもの、あるいは局所塗
布用の軟膏またはクリームの剤形とすることができる。
可能な投与経路としては、例えば、経口、経直腸または非経口経路が含まれる
。もちろん、投与経路は所望の効果に依存する。例えば、前記組成物が肌荒れ、
乾燥皮膚、もしくは老化した皮膚の治療のため、損傷もしくは熱傷を受けた皮膚
の治療のため、あるいは疾患に罹患したもしくは症状を有する皮膚もしくは頭髪
の治療に用いられる場合には、前記組成物は局所的に適用されることになる。
患者に投与される前記組成物の用量は、当業者が決定することができ、例えば
患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態等の種々の因子によって変わる。
前記組成物は、その形態については、例えば溶液、分散物、懸濁液、エマルジ
ョン、または後に再構成される滅菌粉末とすることができる。
さらに本発明の組成物は化粧品の用途にも用いることができる。前記組成物は
、既存の化粧品組成物に加えて混合物を形成してもよく、あるいは単独の組成物
として用いてもよい。
医薬組成物は、PUFA成分を個体に投与するために用いることができる。適当な
医薬組成物は、生理学上許容される滅菌された水性または非水性溶液、分散物、
懸濁物またはエマルジョン及び摂取用の滅菌溶液または分散物に再構成するため
の滅菌粉末を含むものとすることができる。適当な水性及び非水性担体、希釈剤
、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール(プロピレ
ングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等)、適当なそれらの混
合物、植物油（例えばオリーブ油）及び例えばオレイン酸エチルのような注射可
能な有機エステルが挙げられる。適当な流動性は、例えば分散物の場合には必要
な粒径を維持し、また界面活性剤を使用することによって維持され得る。また糖
、塩化ナトリウム等のような等張剤を含めることが望ましい場合もある。前記組
成物は、このような不活性希釈剤の他に、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、
甘味料、着香剤及び芳香剤のような補助剤を含んでもよい。
懸濁物は、その活性成分に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシル化イソステア
リルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微
結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカン
トまたはこれらの物質の混合物等を含むものとすることができる。
錠剤及びカプセル剤のような固体剤形は、当分野において周知の技術を用いて
調製することができる。例えば、本発明のPUFAは、例えばラクトース、ショ糖、
及びコーンスターチのような従来の錠剤基剤を、例えばアラビアゴム、コンスタ
ーチまたはゼラチンのような結合剤、例えばポテトスターチまたはアルギン酸の
ような崩壊剤、及び例えばステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのよう
な滑剤と組み合わせたものにより錠剤化することができる。カプセル剤は、これ
らの賦形剤を酸化防止剤及びPUFA成分とともにゼラチンカプセルに封入すること
により調製することができる。医薬製剤に混和されるべき酸化防止剤及びPUFA成
分の量は、上記の指針の範囲内に収まるようにすべきである。
本明細書において使用される用語「治療」は、望ましくない状態の発症を防止
しあるいは低減することをいう。例えば、免疫抑制を治療するということは、こ
の抑制の発生を防止することか、あるいはこのような抑制の程度を小さくするこ
とをいう。用語「患者」及び「個体」は互換可能に用いられ、両者ともに動物を
示す。本明細書において用いる用語「動物」は、限定するものではないが、イヌ
、ヒト、サル、及び類人猿を含む任意の温血動物をいう。本明細書において用い
られる用語「約」は、使用の事情により記載した範囲または数値から合理的な量
だけ変化する量をいう。本明細書において特定された数値または範囲はいずれも
用語「約」によって変化し得るものと考えるべきである。
「用量」及び「服用量」は、互換可能に用いられ、単回の設定において患者に
摂取され、有効量の抗酸化剤及び構造化トリグリセリドが供給されるように設定
された栄養組成物または医薬組成物の量をいう。当業者には明らかなように、液
体栄養粉末の単回用量または服用量は、上記の量の抗酸化剤及びPUFAを与えるも
のとする。用量または服用量は、通常の成人が一度に消費できる量であるべきで
ある。この量は、患者の年齢、体重、性別または医学的条件によって大きく変化
し得る。しかし、一般的指針のように液体栄養剤の単回服用量または投与量は、
100〜600ml、より好ましくは125〜500ml、最も好ましくは125〜300mlの量を包含
するものと考えるべきである。
本発明のPUFAは食餌の補充が不要な場合でも食品に加えることができる。例え
ば、前記組成物を、限定するものではないが、マーガリン、加工バター、チーズ
、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック類、サラダオイ
ル、調理用の油脂、肉類、魚、及び飲料を含む任意の種類の食品に加えることが
できる。
医薬的用途
医薬的使用（ヒトに対するまたは獣医学上の使用）のためには、前記組成物は
一般に経口投与されるが、前記組成物がうまく吸収される任意の経路、例えば非
経口（即ち皮下、筋肉内、または静脈内）、経直腸、経膣または例えば皮膚用軟
膏またはローションのように局所的経路によっても投与することができる。本発
明のPUFAは、単独で、あるいは医薬上許容される担体または賦形剤とともに投与
することができる。ゼラチンカプセルは、それが使用可能な場合、好ましい経口
投与用の剤形である。上記のような食物補充剤も、投与の経口経路を与え得る。
本発明の不飽和酸は、コンジュゲート形態で、あるいは脂肪酸の塩、エステル、
アミドまたはプロドラッグとして投与することができる。任意の医薬上許容され
る塩は本発明に包含され、特に好ましいのはナトリウム、カリウムまたはリチウ
ム塩である。PCT公開WO96/33155に記載される例えばN-メチルグルカミンのよう
なN-アルキルポリヒドロキサミン塩も包含される。好適なエステルはエチルエス
テルである。固形の塩として、PUFAは錠剤の剤形で投与することもできる。静脈
内投与のため、PUFAまたはその誘導体を、例えばIntralipidのような市販の配合
物に含めることができる。典型的な正常な成人の血漿脂肪酸プロフィールは、6.
64〜9.46％のARA、1.45〜3.11%のDGLA、及び0.02〜0.08%のGLAを含む。これらの
PUFAまたはそれらの代謝前駆体を、単独で、または他のPUFAと混合して投与する
ことにより患者の正常な脂肪酸プロフィールを得ることができる。必要な場合は
、１種類または複数の用途のために、配合物の個々の成分をキットの形態で個別
に提供することができる。特定の脂肪酸の典型的な用量は、一日当たり0.1mg〜2
0g、あるいは100g、好ましくは一日当たり10mgから必要に応じて1、2、5または1
0ｇであり、その誘導体形態の場合はそのモル等量である。トリグリセリドに換
算して約2〜約30重量%の脂肪酸を含む非経口栄養組成物が本発明に包含され、GL
Aとして約1〜約25重量%の全PUFA組成を有する組成物が好ましい(米国特許第5,19
6,198号)。その他のビタミン、特に例えばビタミンA、
D、E及びL-カルニチンのような脂溶性ビタミンを所望に応じて含めることができ
る。必要な場合は、例えばαトコフェロールのような保存剤を、典型的には約0.
1重量%加えることができる。
適当な医薬組成物は、生理学的に許容される滅菌された水性または非水性溶液
、分散物、懸濁物またはエマルジョン、及び滅菌された注射可能な溶液または分
散物に再構成するための滅菌粉末を含み得る。適当な水性及び非水性担体、希釈
剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール(プロピレ
ングリオール、ポリエチレングリコール、グリセロール等)、それらの適当な混
合物、植物油（例えばオリーブ油）及び例えばオレイン酸エチルのような注射可
能な有機エステルが含まれる。適当な流動性は、例えば分散物の場合は必要な粒
径を維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持することが
できる。また、例えば糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を含めることも望ま
しい場合がある。このような不活性希釈剤の他に、前記組成物は、例えば湿潤剤
、乳化剤及び懸濁物、甘味料、着香剤、及び芳香剤のような補助剤も含むものと
することができる。
懸濁物は、活性化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコー
ル、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロー
ス、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカントまたはこれ
らの物質の混合物等のような懸濁化剤を含むものとすることができる。
特に好適な医薬組成物は、水性媒体または溶媒に溶解されたモノ及びジグリセ
リドのジアセチル酒石酸エステルを含む。モノ及びジグリセリドのジアセチル酒
石酸エステルは、約9〜12のHLB値を有し、2〜4のHLB値を有する既存の抗菌剤脂
質より有意に高い親水性を有する。これらの既存の疎水性脂質は、水性組成物に
製剤化することができない。本明細書に開示するように、これらの脂質はモノ及
びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルとともに水性媒体中に可溶化するこ
とができる。この態様では、モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル
(例えばDATEM-C12:0)を、他の活性抗菌脂質(例えば18:2及び12:0モノグリセリド
)に溶解し、混合し均質な混合物を得る。この均質性により抗菌活性を高めるこ
とができる。この混合物は、水に完全に分散することができる。これは、
モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルの添加、及び水に導入する前
に他のモノグリセリドと予備混合することなしには不可能である。次いでこの水
溶性組成物を、生理学上許容される希釈剤、保存剤、バッファー、またはスプレ
ーまたは吸入剤を形成するために必要とされ得る噴霧剤と無菌状態で混合するこ
とができる。
また本発明は、脂肪酸による多くの疾患の治療を包含する。本発明のPUFAの補
充を、血管形成術後の再狭窄を治療するために使用することができる。炎症、リ
ウマチ性関節炎、及び喘息及び感染の症状を本発明のPUFAで治療することができ
る。PUFAがカルシウム代謝に関与し得ることが証明されており、これは本発明の
PUFAを骨粗鬆症や腎及び尿道結石の治療に使用することができることを示唆して
いる。
本発明のPUFAは癌の治療に用いることができる。悪性細胞は変化した脂肪酸組
成を有することが示されており、脂肪酸を加えることによりその増殖を遅延させ
て細胞死をもたらし、またそれらの化学療法剤に対する感受性を高められること
が分かってきた。GLAは癌細胞上でのE-カドヘリン細胞接着分子の再発現を引き
起こすことが分かった。このE-カドヘリン細胞接着分子の欠損は、進行性の転移
と関係する。GLAの水溶性リチウム塩の膵臓癌患者への静脈内投与の臨床試験の
結果、統計的に有意な患者の生存率の上昇が見られた。PUFAの補充は、癌にとも
なうカヘキシーの治療にも有用であり得る。
本発明のPUFAは、糖尿病の治療のためにも用いることができる(米国特許第4,8
26,877号;Horrobinら，Am．J．Clin．Nutr．Vol．57(Suppl.)，732S-737S)。脂
肪酸代謝及び組成の変化が、糖尿病の動物において示されている。これらの変化
は、網膜症、神経障害、腎障害及び生殖系の障害を含む糖尿病によって生じる長
期の合併症のいくつかに関与することが示唆されている。サクラソウ油はGLAを
含み、糖尿病による神経障害を予防し、逆転させることが示されている。
本発明のPUFAは、湿疹の治療、血圧の低下、及び数学的スコアの改善のために
用いることができる。必須脂肪酸の欠乏は湿疹に関与することが示唆されており
、研究の結果、GLAによる治療が湿疹に有効であることが判った。GLAはスト
レスに伴う血圧の上昇を低下させること、及び算術試験の成績を改善することも
判った。GLA及びDGLAは血小板凝集を阻害し、血管拡張を引き起こし、コレステ
ロール濃度を低下させ、また血管壁平滑筋及び繊維組織の増殖を阻害することが
判っている(Brennerら，Adv．Exp．Med，Biol，Vol.83，p.85-101，1976)。GLA
またはDGLAを単独で、あるいはEPAと組み合わせて投与することにより非ステロ
イド抗炎症剤によって生ずる消化管の出血及びその他の副作用が低下または防止
されることが判っている(米国特許第4,666,701号)。GLA及びDGLAが、子宮内膜症
及び月経前症候群を予防または治療し(米国特許第4,758,592号)、筋痛性脳脊髄
炎及びウイルス感染の後の慢性疲労を治療する(米国特許第5,116,871号)ことも
判っている。
本発明のPUFAのさらに別の使用としては、AIDS、多発性硬化症、急性呼吸症候
群、高血圧症及び炎症性皮膚疾患の治療における使用が挙げられる。また本発明
のPUFAは一般的健康並びに老人治療のための配合物に用いることもできる。
獣医学上の用途
上記の医薬及び栄養組成物は、ヒトでの使用のみならず動物についても用いる
ことができ、これは動物もヒトと同様の多くの必要性及び症状を示すからである
。例えば、本発明の油または酸を動物用食餌補充剤において、または動物用食餌
代用物物に用いることができる。
以下の実施例は、例示として示すものであり、限定を意図するものではない。
実施例
実施例１ Mortierella alpinaからのΔ5-デサチュラーゼヌクレオチド配列の
単離
実施例２ Mortierella alpinaからのΔ6-デサチュラーゼヌクレオチド配列の
単離
実施例３ Mortierella alpinaΔデサチュラーゼに相同なΔ6デサチュラーゼ
の同定
実施例４ Mortierella alpinaからのD-12デサチュラーゼ核酸配列の単離
実施例５ Mortierella alpinaからのチトクロームb5還元酵素のヌクレオチド
配列の単離
実施例６ パン酵母におけるM．alpinaデサチュラーゼクローンの発現
実施例７ Ma29トランスジェニックナタネ（Brassica）植物からの葉の脂肪酸
分析
実施例８ Brassica napusにおけるM．alpinaΔ6デサチュラーゼの発現
実施例９ Brassica napusにおけるM．alpinaΔ12デサチュラーゼの発現
実施例10 Brassica napusにおけるM．alpinaΔ6およびΔ12デサチュラーゼの
同時発現
実施例11 Brassica napusにおけるM．alpinaΔ5およびΔ6デサチュラーゼの
同時発現
実施例12 Brassica napusにおけるM．alpinaΔ5、Δ6およびΔ12デサチュラ
ーゼの同時発現
実施例13 Δ6デサチュラーゼ油の立体特異性の分布
実施例14 トランスジェニック植物の脂肪酸組成
実施例15 交雑により達成される、B．napusにおけるΔ6およびΔ12デサチュ
ラーゼの組み合わせ発現
実施例16 大豆におけるM．alpinaデサチュラーゼの発現
実施例17 ヒトデサチュラーゼ遺伝子の配列
実施例１
Mortierella alpinaからのΔ5-デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
Mortierella alpinaは、Δ5-デサチュラーゼにより前駆体20:3からアラキドン
酸(ARA、20:4)を生成する。Mortierella alpinaを起源とするΔ5-デサチュラー
ゼをコードするヌクレオチド配列は、M．alpina第１鎖cDNA及びSynechocystis及
びSpirulinaを起源とするΔ6-デサチュラーゼ間で保存されたアミノ酸配列に対
応する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR増幅により得た。使用し
た手順は以下の通りである。
Hogeら、（1982）Experimental Mycology 6:225-232のプロトコルを用いて、
３
日目のMortierella alpinaのPUFA産生培地から全RNAを単離した。このRNAを用い
、BRLのlambda-ZipLoxsystemをその使用説明書に従って使用して二本鎖cDNAを調
製した。M．alpina cDNAの幾つかのサイズの分画を個別にパッケージして、異な
るインサートの平均サイズを有するライブラリー群を作製した。「完全長」ライ
ブラリーは、平均インサートサイズが1.77kbの約3×106個のクローンを含む。「
シークエンシング級」ライブラリーは、平均インサートサイズが1.1kbの約6×10
5個のクローンを含む。
５μgの全RNAを、BRL Superscript RTase及びプライマーTSyn（5'-CAAGCTTCTG
CAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3'）(配列番号19)を用いて逆転写した。縮重オリゴ
ヌクレオチドを、二種の青緑色細菌Δ6-デサチュラーゼ配列の間で保存された領
域に対して設計した。使用した具体的なプライマーは、D6DESAT-F3(配列番号20)
(5'-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3')及びD6DESAT-R3(配列番号21)(5'-CA
UCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3')であり、ここでY=C+T、R=A+G、及びO=I+Cである
。40ngの全RNAに由来するテンプレート、２pMの各プライマー、200μMの各デオ
キシリボヌクレオチド三リン酸、60mMのTris-Cl，pH8.5、15mMの(NH4)2SO4、２m
MのMgCl2を含む25μl容量中でPCR増幅を行った。サンプルを95度（全ての温度は
摂氏である）で５分間の最初の変性処理にかけた後、72度に保持し、0.2UのTaq
ポリメラーゼを添加した。PCR熱サイクル条件は、94度で１分間、45度で1.5分間
、72度で２分間とした。PCRは35サイクル行った。M．alpinaの第１鎖cDNAに対し
てこれらのプライマーを用いたPCRにより550bpの反応生成物が生成された。M．a
lpinaのPCR断片の推定アミノ酸配列の比較により、Δ6-デサチュラーゼと相同な
領域が判明した(図４参照)。しかし、比較した領域では、配列同一性は約28%に
過ぎなかった。この推定アミノ酸は配列番号14に示される。
このPCR産物をプローブとして用いて、M．alpinaライブラリーから対応するcD
NAクローンを単離した。最も長いcDNAクローンMa29をpCGN5521と命名し、両鎖に
ついて完全に配列決定した。このcDNAは、ベクターpZL1(Bethesda Research Lab
oratories)に最初のATGから始まる1481bpのインサートとして含まれ、446個のア
ミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含む。こ
のリーディングフレームはPCR断片から推定された配列を含む。このcDNAインサ
ートの配列は、Δ6-デサチュラーゼに相同な領域を含んでいることが判った(図
８参照)。例えば、３つの保存的な「ヒスチジンボックス」（他の膜結合デサチ
ュラーゼにおいて観察されている(Okuleyら，（1994）The Plant Cell 6:147-15
8))がMortierella配列のアミノ酸位置171〜175、207〜212及び387〜391に存在し
ていることが判った(図5A〜5D参照)。しかし、Mortierellaデサチュラーゼの第
３のヒスチジンボックスについて典型的な"HXXHW"アミノ酸モチーフは、QXXHHで
あることが判った。コードされたタンパク質のアミノ末端はチトクロームｂ５タ
ンパク質に有意な相同性を示した。従って、Mortierella cDNAクローンは、チト
クロームb5と脂肪酸デサチュラーゼとの融合物を示すものであると考えられる。
チトクロームb5は膜結合デサチュラーゼ酵素に対する電子供与体として機能して
いると考えられることから、このデサチュラーゼタンパク質のＮ末端チトクロー
ムb5ドメインは、その機能に関与している可能性がある。このことは、PUFA産生
のための異種系においてデサチュラーゼを発現する場合に有益であり得る。
実施例２
Mortierella alpinaからのΔ6デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
実施例１に記載したM．alpina cDNAシークエンシング級ライブラリーからのク
ローンのランダムな配列決定により、Mortierella aplina由来のΔ6脂肪酸デサ
チュラーゼをコードする部分的なcDNAクローン、Ma524由来の核酸配列を得た。c
DNA含有プラスミドは以下のように切り出した。
ECLB+カナマイシン(100μg/ml)、0.2％マルトース、および10mM MgSO4中で培
養して37℃にて15分間インキュベートした大腸菌DH10B（ZIP）100μlをファージ
５μlに加えた。SOC（0.9ml）を加え、直ちに細菌（100μl）を10個のECLB+50μ
g Penプレートの各々に載せた。45分間の回復時間は必要としなかった。これら
のプレートを一晩37℃にてインキュベートした。コロニーを取り出してECLB+50
μg Pen培地中に入れ、一晩培養して、グリセロールストックおよびminiprep DN
Aを作製するために使用した。ECLB+50μg Pen/ml上に載せる
と、100μg/ml Penに載せたときよりも、より多くのコロニーができ、インサー
トを含むコロニーの割合が増えた。
ランダムにコロニーを取り出し、Qiagen miniprepキットを用いてプラスミドD
NAを精製した。cDNAインサートの5'末端からDNA配列を得て、BLASTアルゴリズム
を用いてデータベースと比較した。Ma524は、以前同定されたΔ6デサチュラーゼ
と相同なDNA配列に基づいて推定Δ6デサチュラーゼとして同定された。M．alpin
aライブラリーから全長cDNAクローンを単離した。このクローンの発生量はMa29
よりもわずかに（2×）少ないと思われる。Ma524はCaenorhabditis elegansコス
ミド、WO6D2.4、ヒマワリ由来のチトクロームd5/デサチュラーゼ融合タンパク質
、および公共データバンクの２つのΔ6デサチュラーゼ（SynechocystisおよびSp
irulina由来のもの）の一部に有意な相同性を示す。
さらに、Ma524はルリチシャΔ6-デサチュラーゼの配列（PCT公開WO96/21022）
に有意な相同性を示す。したがって、Ma524はルリチシャおよび藻のΔ6-デサチ
ュラーゼに関連するΔ6-デサチュラーゼをコードすると思われる。Ma524および
ルリチシャΔ６のアミノ酸配列は類似しているが、cDNAの塩基組成はずいふん異
なる。ルリチシャcDNAは全塩基組成の60％がA+Tであり、幾つかの部分ではA+Tが
70％を超えるが、Ma524の平均A+T塩基組成は44％であり、60％を超える領域はな
い。これは、異なる塩基組成を好む微生物または動物におけるcDNAの発現を示唆
するものであるかもしれない。組換え遺伝子の発現の乏しい発現は、宿主が、導
入遺伝子とは非常に異なる塩基組成を有する場合に起こり得る。このような乏し
い発現のための推測されるメカニズムは、mRNAの安定性または翻訳可能性の低下
を含む。
実施例３
Mortierella alpina Δ6-デサチュラーゼに相同なΔ6-デサチュラーゼの同定
Ma524アミノ酸配列を用いて、NCBIによるestデータベースのBLASTX検索により
、推定Δ6-デサチュラーゼをコードする核酸配列を同定した。幾つかの配列は、
有意な相同性を示した。特に、２つのArabidopsis thaliana配列の推定アミノ酸
配列（受託番号F13728およびT42806）は、Ma524の推定アミノ酸配列の
２つの異なる領域に対して相同性を示した。以下のPCRプライマーを設計した：
ATTS4723-FOR（F13728に相補的）5'-CUACUACUACUAGGAGTCCTCTACGGTGTTTTG（配列
番号22）およびT42806-REV（T42806に相同的）5'-CAUCAUCAUCAUATGATGCTCAAGCTG
AAACTG(配列番号23)。BRL Superscript RTアーゼおよびプライマーTSyn 5'-CCAA
GCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号24）を用いて、Arabidopsis th
alianaの発生長角果から単離した全長RNA5μgを逆転写した。25ngの全長RNAから
得たテンプレート、各々2pMのプライマー、各々200μMのデオキシリボヌクレオ
チド三リン酸、60mM Tris-Cl，pH8.5，15mM(NH4)2SO4、2mM MgCl2，0.2U Taqポ
リメラーゼを含む50ul容量中で、PCRを行った。サイクル条件は以下の通りであ
った：94℃にて30秒、50℃にて30秒、72℃にて30秒。PCRを35サイクル続けたあ
と、72℃にて７分間さらに伸長を行った。PCRにより約750塩基対からなる断片が
得られ、つぎにこれをサブクローン化して12-5と名づけ、配列決定した。この断
片の各端部は、そのPCRプライマーが得られたArabidopsis estに対応する。これ
は、12-5と呼ばれる配列である。12-5の推定アミノ酸配列を、Ma524のもの、お
よびヒト(W28140)、マウス(W53753)、およびC．elegans(R05219)からのestと比
較する(図４)。相同性に基づき、これらの配列はデサチュラーゼポリペプチドを
表わす。この全長遺伝子は、該est配列に基づくプローブを用いてクローン化す
ることができる。つぎに、この遺伝子を発現ベクターの中に配置して宿主細胞中
で発現させることができ、これらの特定のΔ6-または他のデサチュラーゼ活性を
以下のように決定することができる。
実施例４
Mortierella alpinaからのΔ-12デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
それが蓄積する脂肪酸に基づき、Mortierella alpinaはω6-型デサチュラーゼ
を有する。ω6デサチュラーゼはオレイン酸（18：1）からのリノール酸（18：2
）の生成に関与する。リノール酸（18：2）は、Δ6デサチュラーゼのための基質
である。この実験は、Mortierella alpinaがΔ12-デサチュラーゼポリペプチド
を有するかどうかを決定し、もし有するのであれば、対応するヌクレオ
チド配列を同定するするために設計される。M．alpinaシークエンシング級ライ
ブラリーからランダムに選んだコロニー、Ma648を配列決定し、以前に同定され
たデサチュラーゼと相同なDNA配列に基づいて推定デサチュラーゼとして同定し
た(Ma524について記載のとおり(実施例２を参照のこと))。Ma648 cDNAの5'末端
から得たこの推定アミノ酸配列は、大豆ミクロソームω6（Δ12）デサチュラー
ゼ（受託番号L43921）およびピマの実のオレイン酸12-ヒドロキシラーゼ（受託
番号U22378）に対して有意な相同性を示す。さらに、種々の他のω6（Δ12）お
よびω3（Δ15）脂肪酸デサチュラーゼ配列に対する相同性を観察する。
実施例５
Mortierella alpinaからのチトクロームb5還元酵素ヌクレオチド配列の単離
Mortierella alpinaからチトクロームb5還元酵素をコードする核酸配列を以下
のようにして得た。実施例１に記載したように、Mortierella alpinaから単離し
た全長RNAに基づいてcDNAライブラリーを構築した。これらのクローンのうちの
１つ、M12-27の5'末端および3'末端からDNA配列を得た。M12-27の3'末端の推定
アミノ酸配列を用いて公共データバンクの検索を行ったところ(図５を参照のこ
と)、既知のチトクロームb5還元酵素の配列に対して有意な相同性を示した。特
に、49アミノ酸領域にわたり、Mortierellaクローンは、ブタ由来のチトクロー
ムb5還元酵素と55％の同一性（73％の相同性）を共有する(図４参照）。
実施例６
パン酵母におけるM．alpinaデサチュラーゼクローンの発現
酵母の形質転換
酵母の酢酸リチウム形質転換は、標準的なプロトコル(Methods in Enzymology
，Vol．194，p．186−187，1991)に従って行った。概略を述べると、まず酵母を
YPDにおいて30℃で増殖させた。細胞を遠心分離により沈殿させ、TEに再懸濁し
、再度遠心分離により沈殿させ、100mMの酢酸リチウムを含むTEに再懸濁し、
再度遠心分離により沈殿させ、さらにTE/酢酸リチウムに再懸濁した。再懸濁し
た酵母を、30℃で60分間震盪培養した。キャリアDNAを加え、酵母を試験管に一
定分量に分けた。形質転換DNAを加え、試験管を30℃で30分間インキュベートし
た。PEG溶液(35%(w/v)PEG4000、100mM酢酸リチウム、TE pH7.5)を加え、その後3
0℃で50分間インキュベートした。42℃で５分間の熱ショックを行い、細胞をペ
レット化し、TEで洗浄し、再度ペレット化しTEに再懸濁した。次に再懸濁された
細胞を選択培地上にプレート化した。
形質転換された酵母におけるデサチュラーゼの発現
Mortierella alpinaを起源とするcDNAクローンをパン酵母におけるデサチュラ
ーゼ活性についてスクリーニングした。アブラナΔ15-デサチュラーゼ(刊行物に
記載された配列(ArondelらScience 258:1353-1355)に基づくプライマーを用いて
、Brassica napus品種212/88種子からの第１鎖cDNAを用いたPCRにより得られた
もの)を陽性対照として用いた。Δ15-デサチュラーゼ遺伝子とcDNAクローンMa29
からの遺伝子を発現ベクターpYES2(Invitrogen)に挿入し、プラスミドpCGR-2及
びpCGR-4をそれぞれ得た。これらのプラスミドをS．cerevisiae酵母株334にトラ
ンスフェクトし、特異的デサチュラーゼ活性の検出を可能にする基質の存在下で
、ガラクトースによる誘導の後に発現させた。対照株は変更していないpYES2ベ
クターを含むS．cerevisiae株334とした。使用した基質、産生された生成物、及
び示されたデサチュラーゼ活性は、DGLA(ARAへの変換がΔ5-デサチュラーゼ活性
を示す)、リノレン酸(GLAの変換がΔ6-デサチュラーゼ活性を示し、ALAの変換が
Δ15-デサチュラーゼ活性を示す)、オレイン酸(S.cerevisiaeによって生成され
る内在基質、リノレン酸への変換がΔ12-デサチュラーゼ活性を示し、S．cerevi
siaeはこれを欠いている)、またはARA(EPAへの変換がΔ17-デサチュラーゼ活性
を示す)であった。結果を以下の表１に示す。脂質分画は以下のように抽出した
。培養物を15℃で48〜52時間増殖させた。細胞を遠心分離によりペレット化し、
滅菌ddH2Oで一回洗浄し、再度ペレット化した。このペレットをメタノールとと
もに攪拌し、クロロホルムを(内部標準としての)トリトリデカノインとともに加
えた。混合物を室温で１時間以上、あるいは4℃
で一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、１ｇの無水硫酸ナトリウ
ムとともににWhatmanフィルターを通して濾過し、粒子及び残留水を除去した。
窒素流下40℃で有機溶媒を蒸発させた。次に抽出された脂質を、２mlのメタノー
ル中の0.5Ｎ水酸化カリウムを密閉管に加えることにより、ガスクロマトグラフ
ィー分析(GC)用の脂肪酸メチルエステル(FAME)に誘導化した。サンプルを30分間
95〜100℃に加熱し、室温まで冷却した。約２mlのメタノール中の14％三フッ化
ホウ素を加え、加熱処理を繰り返した。抽出された脂質混合物を冷却した後、２
mlの水及び１mlのヘキサンを加え、GCによる分析用のFAMEを抽出した。パーセン
トへの変換は、産生された生成物を、(産生された生成物及び加えた基質の)合計
で除し、100を乗ずることによって計算した。オレイン酸パーセント変換を計算
するためには、基質が加えられないので、生成されたリノレン酸の総量を、(産
生されたオレイン酸とリノレン酸の)合計で除し100を乗ずる。
Δ15-デサチュラーゼ対照クローンは16.3%の基質の変換を示した。Ma29 cDNA
を発現するpCGR-4クローンは、15.3%の20:3基質を20:4w6に変換し、これは該遺
伝子がΔ5-デサチュラーゼをコードすることを示す。バックグラウンド(基質の
非特異的変換)は、これらの場合では0〜3%であった。Ma524 cDNAを発現するpCGR
-5クローンは、6％の基質のGLAへの変換を示し、これは、該遺伝子がΔ6-デサチ
ュラーゼをコードすることを示している。Ma648 cDNAを発現するpCGR-7クローン
は、63.4％の基質のLAへの変換を示し、これは、該遺伝子がΔ12-デサチュラー
ゼをコードすることを示している。また、我々は異なる濃度の基質を用いること
によって活性の基質阻害を見出した。基質を100μMまで加えた場合、基質を25μ
Mまで加えた場合と比較して生成物へのパーセント変換が低下した(下記参照)。
これらのデータは、異種系において異なる基質特異性を有するデサチュラーゼが
発現され得、PUFAを生成するのに用いることができるということを示している。
表２に、表示したプラスミドによって酵母宿主S．cerevisiae 334から抽出さ
れた脂質の総量のパーセントとして対象の脂肪酸を示す。増殖培地にはグルコー
スは存在していなかった。アフィニティーガスクロマトグラフィーを用いて各脂
質を分離した。GC/MSを用いて生成物の種類を確認した。B．napusΔ15-デサチュ
ラーゼについて予測される生成物であるα-リノレン酸は、その基質であるリノ
ール酸を誘導酵母培地に外部から加えたときに検出された。この知見は、デサチ
ュラーゼ遺伝子の酵母での発現によって、その場合の増殖条件下で機能的酵素及
び検出可能な量の生成物が産生することができることを示している。この外部か
ら添加された両基質は酵母に取り込まれるが、何れかを誘導酵母培地に遊離形態
で加えると、より長い鎖のPUFA、ジホモ-γ-リノレン酸(20:3)が酵母に組込まれ
る量はリノール酸(18:2)より僅かに少ない。S．cerevisiae 334(pCGR-5)の誘導
および発現の際にリノール酸が存在する場合は、γ-リノレン酸が検出された。
このPUFAの存在は、pCGR-5(MA524)からのΔ６デサチュラーゼ活性を示す。リノ
ール酸（S．Cerevisiae 334(pCGR-7)の発現から抽出された脂質において同定さ
れた）は、M．alpinaを起源とするcDNA MA648をΔ12-デサチュラーゼと
して分類する。
表の凡例
18:1 =オレイン酸
18:2 =リノール酸
α-18:3=α-リノレン酸
γ-18:3=γ-リノレン酸
18:4 =ステアリドン酸
20:3 =ジホモ-γ-リノレン酸
20:4 =アラキドン酸
実施例７
植物におけるΔ5デサチュラーゼの発現
葉における発現
この実験は、（ノーザンによる決定で）Ma29を発現する葉が外因的に適用され
たDGLA（20：3）をARA（20：4）に変換することができるかどうかを決定するた
めに設計された。
Ma29デサチュラーゼcDNAをPCRにより改変し、クローン化に都合のよい制限部
位を導入した。デサチュラーゼ・コーディング領域は、アブラナ属植物（Brassi
ca）の葉における発現のための二重35Sプロモーターの制御の下でd35カセット（
pCGN5525）に、標準プロトコル（USPN 5,424,200及びUSPN 5,106,739を参照）に
従って挿入されている。pCGN5525を含むトランスジェニックアブラナ属植物を標
準プロトコルに従って産生させた（USPN 5,188,958及びUSPN 5,463,174を参照）
。
最初の実験においては、3種類の植物を用いた：対照LPOO4−1、並びに2種類の
トランスジェニック体、5525−23及び5525−29。LP004は低リノレン・アブラナ
属変種である。各々の葉を３種類の処理のうちの１つのために選択した：
水、GLA又はDGLA。GLA及びDGLAはナトリウム塩としてNuChek Prepから購入し、
１mg／mlで水に溶解した。一定分量をＮ2の下で覆い、−70℃で保存した。50μl
の液滴を上面に適用し、手袋を着用した指で穏やかに広げて全面を覆うことによ
り葉を試験した。塗布は、塗布した脂肪酸のあらゆる光酸化を最小限に止めるた
め、光サイクルの最後の約30分前に行った。処理の6日後に、各々の処理から1枚
の葉を回収し、中央脈を経て半分に切断した。半分の一方は水で洗浄し、取り込
まれない脂肪酸の除去を試みた。葉のサンプルを一晩凍結乾燥し、脂肪酸の組成
をガスクロマトグラフィー（GC）で決定した。それらの結果を表3に示す。
GLAで処理した葉は1.56〜2.4重量％のGLAを含んでいた。脂肪酸分析では、対
照とトランスジェニック葉との脂質組成が本質的に同じであることが示された。
DGLAで処理した対照植物の葉は1.2−1.9重量％のDGLA及びバックグランド量のAR
A（.26−.27重量％）を含んでいた。トランスジェニック葉は僅かに.2−.7重量
％のDGLAを含むだけであったが、ARAの量は増加しており（.74−1.1重量％）、
これらの葉においてDGLAがARAに変換されたことが示された。
種子における発現
この実験の目的は、種子特異的ナピン（napin）プロモーターを含む構築体が
種子において発現可能であるかどうかを決定することであった。
Ma29 cDNAを、以下のプライマー：
Madxho−順方向：
Madxho−逆方向：
を用いてPCRによって改変し、それぞれ、開始及び終止コドンの上流及び下流にX
hoIクローニング部位を導入した。
このPCR産物をpAMP1（GIBCOBRL）にCloneAmpシステム（GIBCOBRL）を用いてサ
ブクローン化してpCGN5522を作製し、両鎖の配列決定を行うことによりΔ5デサ
チュラーゼ配列を確認した。
種子特異的発現のため、Ma29コーディング領域をpCGN5522からXhoI断片として
切り出し、ナピン発現カセットpCGN3223のSalI部位に挿入してpCGN5528を作製し
た。ナピン5’調節領域、Ma29コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含む
pCGN5528のHindIII断片をpCGN1557のHindIII部位に挿入し、ｐCGN5531を作製し
た。2コピーのナピン転写単位を縦列状態で（in tandem）挿入した。この縦列構
築体は、遺伝子座当たリデサチュラーゼを高発現させること
ができる。pCGN5531をアブラナ（Brassica napus）cv.LPOO4にアグロバクテリウ
ム（Agrobacterium）仲介形質転換により導入した。
成熟T2種子の20種子のプールの脂肪酸組成をGCで分析した。表4は、独立した
形質転換系で得られた結果を非形質転換LPOO4種子と比較して示す。pCGN5531を
含むトランスジェニック種子は対照種子には存在しない2種類の脂肪酸を含み、
これらはオレイン酸及びリノール酸に対するそれらの溶出に基づいて仮にタキソ
ール酸（taxoleic acid）（5,9−18：2）及びピノレン酸（pinolenic acid）（5
,9,12−18：3）と同定された。これらは、オレイン酸及びリノール酸のΔ５不飽
和化の予想産物である。これらのトランスジェニック種子では、他の脂肪酸組成
に違いは認められなかった。
Ma29を発現するものを同定するため、ノーザン分析を植物に対して行なう。開
花の約25日後又はナピンプロモーターが誘発されたときに発生胚を単離し、実施
例7に記載されるようにGLA又はDGLAを含む溶液に浮かべる。次に、実施例7にお
いて葉に適用したプロトコルに従い、胚の脂肪酸分析をGCにより行ってDGLAから
ARAへの変換量を決定する。その後、内在性アブラナ属アシルトランスフエラー
ゼによってトリグリセリドに取り込まれたARAの量を実施例7と同様にGCで評価す
る。
実施例８
アブラナ（Brassica napus）におけるM．アルピナ（M．alpina）
Δ6デサチュラーゼの発現
以下のプライマー：
を用いてMa524 cDNAをPCRにより改変し、クローニング部位を導入した。
これらのプライマーは全コーディング領域の増幅を可能にし、XbaI及びXhoI部
位を5’末端に、並びにXhoI及びStuI部位を3’末端に追加した。そのPCR産物をC
loneAmpシステム（GIBCOBRL）を用いてpAMP1（GIBCOBRL）にサブクローン化して
pCGN5535を作製し、両鎖の配列決定を行うことによりΔ6デサチュラーゼ配列を
確認した。
種子特異的発現のため、Ma524コーディング領域をXhoI断片としてpCGN5535か
ら切り出し、ナピン発現カセットpCGN3223のSalI部位に挿入してpCGN5536を作製
した。ナピン5’調節領域、Ma524コーディング領域、及びナピン3’調節領域を
含むpCGN5536のNotI断片をpCGN1557のNotI部位に挿入し、pCGN5538を作製した。
pCGN5538をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブ
ラナ(Brassica napus)cv.LP004に導入した。
成熟するT2種子を、温室内の6つの独立した形質転換結果物から集めた。単一
の種子の脂肪酸組成をGCにより分析した。表5は対照LP004種子及び6つの5538系
統の結果を示す。＃８を除く全ての5538系統はGLAを含む種子を産生した。T2自
家受粉種子集団について予想されるように、GLAの存在はこれらの種子において
遺伝形質分離(segregate)した。GLAに加えて、M．アルピナΔ6デサチュラーゼは
18：4（ステアリドン酸（stearidonic acid））及び6,9−18：2であるものと思
われる他の脂肪酸を産生することが可能である。
上述の結果は、３種類の異なる基質特異性を有するデサチュラーゼを異種系に
おいて発現させ、多不飽和長鎖脂肪酸の産生に用いることができることを示す。
前駆体20：3（DGLA）からのARA（20：4）の産生、18：2基質からのGLA（18：3）
の産生、及びGLAの前駆体である18：2への18：1基質の変換が例証された。
実施例９
アブラナ(Brassica napus)におけるM．アルピナΔ12デサチュラーゼの発現
以下のプライマー：
これらのプライマーは全コーディング領域の増幅を可能にし、BamHI部位を５
’末端に、並びにKpnI及びXhoI部位を3’末端に追加した。そのPCR産物をCloneA
mpシステム（GIBCOBRL）を用いてpAMP1（GIBCOBRL）にサブクローン化してpCGN5
540を作製し、両鎖の配列決定を行うことによりΔ12デサチュラーゼ配列を確認
した。
種子特異的発現のため、Ma648コーディング領域をBamHI/XhoI断片としてpCGN5
54Oから切り出し、ナピン発現カセットpCGN3223のBglII及びXhoI部位の間に挿入
してpCGN5542を作製した。ナピン5’調節領域、Ma648コーディング領域、及びナ
ピン3’調節領域を含むpCGN5541のAsp718断片をpCGN5138のAsp718部位に挿入し
、pCGN5542を作製した。pCGN5542をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブ
ラナ(Brassica napus)の２種類の変種に導入した。市販のアブラナ変種SP30021
、及び低リノレン系統LP30108を用いた。
成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた19の独立したLP30108形質転換結
果物及び非形質転換対照から集めた。これらの種子はΔ12デサチュラーゼ導入遺
伝子について遺伝形質分離することが予想される。20種子のプールの脂肪酸組成
をGCにより分析した。それらの結果を表6に示す。全ての形質転換系統は、Δ12
デサチュラーゼの産生物である増加した量の18：2を含有していた。18：3の量は
これらの植物においては大きく増加してはいなかった。結果物＃11及び16はプー
ルした種子において18：2の最大蓄積を示した。これらのT2種子における18：2の
量の遺伝形質分離を調べて、後代に引き継がれる個々の植物を同定するため、半
種子（half-seed）分析を行った。種子を一晩、暗所において、3
0度で、水に浸した瀘紙上で発芽させた。外子葉をGC分析のために切除し、残り
の実生は土壌に植えた。これらの分析のうちの幾つかの結果を表7に示す。M.ア
ルピナΔ12デサチュラーゼを含む個々のT2種子は最高60％の18：2をこれらの種
子中に蓄積していた。サンプル97xx1116＃59は遺伝形質分離のない(null segreg
ant)例である。最高の18：2蓄積体においても、18：3の濃度はわずかに増加した
だけであった。これらの、及び他の個別に選択されたT2植物を温室内及び野外で
成長させ、T3種子を産生させた。
成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた20個の独立したSP30021形質転換
結果物及び非形質転換対照から集めた。これらの種子はΔ12デサチュラーゼ導入
遺伝子について遺伝形質分離することが予想される。20種子のプールの脂肪酸組
成をGCにより分析した。そのデータは表8に提示されている。全ての形質転換系
統は、Δ12デサチュラーゼの産生物である増加した量の18：2を含有していた。
低リノレンLP30108系統と同様に、18：3の量は大きく増加してはいなかった。結
果物＃4及び12はプールした種子において18：2の最大蓄積を示した。これらのT2
種子における18：2の量の遺伝形質分離を調べて、後代に引き継がれる個々の植
物を同定するため、半種子分析を行った。種子を一晩、暗所において、30度で、
水に浸した濾紙上で発芽させた。外子葉をGC分析のために切除し、残りの実生は
土壌に植えた。これらの分析のうちの幾つかの結果を表9に示す。サンプル97xx1
157＃88及び＃18は、それぞれ、5542−SP30021−4及び5542−SP30021−12につい
て遺伝形質分離のないの無偏出の例である。これらの、及び他の個別に選択され
たT2植物を温室内及び野外で成長させ、T3種子を産生させた。
実施例10
アブラナ(Brassica napus)におけるM．アルピナΔ6及びΔ12デサチュラーゼの
同時発現
M．アルピナΔ6及びΔ12デサチュラーゼを同じT−DNAから発現させるため、以
下の種子特異的発現のための構築体を作製した。
ナピン5’調節領域、Ma524コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むp
CGN5536のNotI断片をpCGN5542のNotI部位に挿入し、pCGN5544を作製した。発現
モジュールは、Ma524及びMa648及びnptIIマーカーからの転写の方向が同じにな
るように配向した。
pCGN5544をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブラナ(Brassica napus)
cv.LP30108に導入した。成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた16個の独立
したLP30108形質転換結果物及び非形質転換対照から集めた。これらの種子はΔ6
＋Δ12デサチュラーゼ導入遺伝子について遺伝形質分離することが予想される。
20種子のプールの脂肪酸組成をGCにより分析した。それらの結果が表10に提示さ
れている。系統のうちの１つ（5544−LP30108−3）を除く全ての形質転換系統が
、対照と比較して油組成の変化を示す。GLAは系統のうちの3つ（−3、−4、−11
）を除く全てにおいて産生された；GLAを含まないこれら3つのうちの2つ（−4、
−11）は18：2の増加を示し、これはΔ12デサチュラーゼの発現を示すものであ
る。群としては、二重Δ6＋Δ12構築体（pCGN5544）を含む植物において観察さ
れるGLAの量は、pCGN5538（Δ6単独）を含む植物よりも高かった。加えて、Δ6,
918：2の量は、Δ6単独と比較して、Δ12＋Δ6を含む植物において大きく低下し
ていた。したがって、１つのT−DNA上でのΔ6及びΔ12デサチュラーゼの組み合
わせは、Δ6デサチュラーゼ単独の発現よりも多くのGLA及び少ない副生物の蓄積
につながる。これらのT2種子におけるGLA量の遺伝形質分離を調べて、後代に引
き継がれる個々の植物を同定するため、半種子分析を行った。種子を一晩、暗所
において、30度で、水に浸した濾紙上で発芽させた。外子葉をGC分析のために切
除し、残りの実生は土壌に植えた。これらの分析のうちの幾つかの結果を表11に
示す。T2集団について予想されるように、
GLA及び18：2の量は個々の種子において遺伝形質分離している。全脂肪酸のうち
の60％以下のGLA含量が個々の種子において観察された。個々の結果物を選択し
、T3種子を産生させるために温室内及び野外で成長させた。
本発明の構築体を発現する、アブラナ属植物、ダイズ、ベニバナ、トウモロコ
シ、アマ及びヒマワリを含むトランスジエニック植物がGLAの良好な供給源であ
り得る。
ルリチシャのようなGLAの典型的な供給源が産生するGLAは、最大でも25％であ
る。対照的に、表10における植物は最高30％のGLAを含む。さらに、表11に示さ
れる個々の種子は最高60％のGLAを含む。
実施例11
アブラナ(Brassica napus)におけるM．アルピナΔ5及びΔ6デサチュラーゼの同
時発現
トランスジェニックアブラナの油中にアラカドン酸（arachadonic acid）（AR
A）を産生させるため、Δ5及びΔ6デサチュラーゼ活性を導入する必要がある。
下流の特徴付け及び繁殖を容易にするため、両活性を単一のT−DNAによってコー
ドさせることが有利であり得る。以下の例はΔ5及びΔ6デサチュラーゼの同時発
現を説明する。
ナピン5’調節領域、Ma29コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpC
GN5528のAsp718断片をpCGN5138のAsp718部位に挿入し、pCGN5545を作製した。ナ
ピン5’調節領域、Ma524コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpCGN5
536のNotI断片をpCGN5545のNotI部位に挿入し、pCGN5546を作製した。発現モジ
ュールは、Ma524及びMa29及びnptIマーカーからの転写の方向が同じになるよう
に配向した。
pCGN5546をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブラナ(Brassica napus)
cv.LP30108に導入した。成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた30個の独立
したLP30108形質転換結果物から集めた。20種子のプールの脂肪酸組成をGCによ
り分析した。それらの結果を表12に示す。Δ5,918：2（pCGN5531植物に見られる
）及びΔ6,918：2及びGLA（pCGN5538植物に見られる）の存在によって立証され
るように、全ての系統が両デサチュラーゼの発現を示す。
実施例12
アブラナ(Brassica napus)におけるM．アルピナΔ5、Δ6及びΔ12デサチュラ
ーゼの同時発現
トランスジェニックアブラナの油中におけるARAの最適な産生を達成するため
には、Δ5活性に加えてΔ6及びΔ12デサチュラーゼ活性の両者が存在する必要が
あり得る。下流の特徴付け及び繁殖を容易にするため、これらの活性の全てを単
一のT−DNAによってコードさせることが有利であり得る。以下の例はΔ5、Δ6及
びΔ12デサチュラーゼの同時発現を説明する。
ナピン5’調節領域、Ma29コーディング領域、及びナピン3’調節領域を含むpC
GN5528のHindIII断片をpCGN5544のHindIII部位に挿入し、pCGN5547を作製した。
発現モジュールは、Ma29，Ma524，Ma648及びnptIIマーカーからの転写の方向が
同じになるように配向した。
pCGN5547をアグロバクテリウム仲介形質転換によりアブラナ(Brassica napus)
cv.LP30108に導入した。成熟自家受粉T2種子を、温室内で成長させた30個の独立
したLP30108形質転換結果物から集めた。20種子のプールの脂肪酸組成をGCによ
り分析した。それらの結果を表13に示す。27の系統がかなりの量のGLAの蓄積を
示し、一般には、観察されたGLAの量は、Δ12デサチュラーゼを含まない5546植
物において見られるものよりも高かった。大部分の植物において、検出可能なΔ
6,9 18：2の量及び高い18：2の量が欠如していることによって立証されるよう
に、このΔ12デサチュラーゼはほとんどの系統において活性であるものと思われ
る。その濃度は一般には5546植物において観察されるものを下回るものの、少量
のΔ5,9 18：2が5547植物において見られる。これは、Δ5位置で不飽和化可能
となる前に18：1を18：2に効率的に変換するΔ12デサチュラーゼの存在によるも
のである可能性がある。
実施例13
Δ6−不飽和化油の立体特異的分布
この実験は、pCGN5538（Ma524 cDNA）を発現する種子におけるΔ6−不飽和化
油の立体特異的分布を調べるために設計された。3種類の種子サンプルを用いた
：
1）非形質転換アブラナ(B．napus)cv.LP004種子（対照）
2）pCGN5538−LP004−19の、遺伝形質分離するT2種子
3）pCGN5538−LP004−29の、遺伝形質分離するT2種子
以下のプロトコルを分析に用いた：
1．種子油の抽出
50個の種子を12×32ｍｍバイアルに入れ、ガラス棒で粉砕した。1.25ｍＬのヘ
キサンを添加し、その混合物を渦巻き巻き攪拌した。振盪器で種子を一晩抽出し
た。次に、この抽出物を、1ccシリンジに装着した0.2ミクロンフィルターを通し
て濾過した。その後、この抽出物を窒素の下で乾燥させた。生じた油を全油サン
プルの消化及び誘導体化に用いた。
2．消化
A．液体油消化
TAGの50％消化を得るため、貯蔵リパーゼ（Rhizopus arrhizus由来、Sigma、L
4384）を約600,000単位／ｍＬに希釈した。この貯蔵リパーゼを4℃に維持し、氷
上に置く。試薬の量は消化しようとする油の量に従って調整することができる。
以下の量は2.0mgの抽出油サンプルに基づくものである。12×32ｍｍスクリュ
ーキャップバイアルに以下のものを加えた：2.0mgの油、200μLの0.1MトリスＨ
Ｃｌ pH7、40μLの2.2w／v％ＣａＣｌ2 2Ｈ2Ｏ、及び100μLの0.05w／v％胆汁
酸塩。これらの物質を渦巻き攪拌及び超音波処理して油中に分散させた。20μL
の希釈リパーゼを添加し、その混合物を室温で1.0分間連続的に渦巻き攪拌した
。白色沈殿が形成された。反応を100μLの6M ＨＣｌ及び渦巻き攪拌で停止させ
た。500μLのＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ（2：1）を添加し、その混合物を渦巻き攪拌
して、残りの消化を行う間氷上に保持した。サンプルを再度渦巻き攪拌
し、簡単に遠心分離して層を明確した。消化産物を含む下層をパスツールピペッ
トで取り出し、12×32ｍｍクリンプキャップ・バイアルに入れた。次に、この物
質を300μLのＣＨＣｌ3で再抽出し、渦巻き攪拌し、遠心分離して、下層と合わ
せた。できる限り多い量の氷の上に消化産物を保持した。消化の後できるだけ早
くHPLC分離を行ってアシル移動（acyl migration）を最小化した。
B．固形脂肪消化
20μlの11：0メチルエステルを2.0mgの固形脂肪に添加することを除いて、上
述の液体油消化の手順に従った。
3．HPLC分離
消化産物をクロロホルム中で約200μLまで乾燥させた。次に、各々のサンプル
を8×40mmシェルバイアル（shell vial）内のインサートに移し、30μLをHPLC分
析のために注入した。
この高速液体クロマトグラフィー・システムは、管温度が105℃で窒素ガス流
が40mL／分であるVarex ELSD IIA蒸発光散乱検出器；Waters 712 Wispオートサ
ンプラー、3つのBeckman 114M Solvent Delivery Module；Beckman 421Aコント
ローラー、Rheodyne気体作動流(pneumatically actuated stream)型スプリッタ
ー；及びGilsonマイクロ・フラクショネーターを備えていた。クロマトグラフィ
ーカラムは、Brownleeによる220×4.6mm、5ミクロン正常相シリカ・カートリッ
ジである。
用いた3種類の溶媒は：
A＝ヘキサン：トルエン 1：1
B＝トルエン：酢酸エチル 3：1
C＝酢酸エチル中5％のギ酸
であった。
勾配プロフィールは以下の通りであった：
クロマトグラフィー標準混合液は、ヘキサン：トルエン 1：1中に以下のもの
を含めて調製する：
0.2mg／mLトリグリセリド16：0
2.0mg／mL 16：0遊離脂肪酸
0.2mg／mLジ16：0混合異性体（1，2−ジアシルグリセロール及び1，3−ジアシル
グリセロール）
0.2mg／mL 3−モノアシルグリセロール16：0
0.2mg／mL 2−モノアシルグリセロール16：0
各々のサンプルについて、2−magピークを含む画分をコントロールド・タイム
ド・イベンツ・リレー（controlled timed events relays）の方法により自動的
に集める。検出器をコレクターのエミッターと同期させるのに時間遅延を用いる
。2−magピークを集め、それらの画分を室温で一晩蒸発させる。
sn−2組成の結果はアシル移動の最小化に依存する。クロマトグラフィーにお
ける1−モノアシルグリセロール及び／又は3−モノアシルグリセロールピークの
出現は、アシル移動が生じていることを意味する。
4．誘導体化
全油を誘導体化するため、1.0mgの抽出油全体を秤量して12×32ｍｍクリンプ
キャップ・バイアルに入れた。その後、1mLのトルエンを添加した。次に、この
サンプルを渦巻き攪拌し、誘導体化のために50μLアリコートを取り出した。
乾燥した2−magサンプルに50μLのトルエンを添加した。全油及び2−mag画分に1
05μLの8.76重量％Ｈ2ＳＯ4／ＣＨ3ＯＨを添加する。キャップをきつく締め、サ
ンプルを95℃で１時間還流させた。サンプルを冷却し、500μLの水中10w／v％の
ＮａＣｌ及び60μLのヘプタンを添加した。有機層を取り出し、12×32mmクリン
プキャップ・バイアルに挿入した。
5．GLC分析
スプリット／スプリットレス・キャピラリほ導入口、FID検出器、6890シリー
ズ・オートサンプラー及び3392A Alpha Omegaインテグレーターを備えるHewlett
Packardモデル6890 GCを、キャピラリーカラムに対して以下のように設定する
：
A．Supelco Omegawax 250、30m長、0.25mm内径、0.25μm膜厚
注入口： 260℃
検出器： 270℃
初期温度： 170℃
初期時間： 1.5分
速度： 30度／分
最終温度： 245℃
最終時間： 6.5分
注入容量： 1.5μL
ヘッド圧： 25psi
スプリット比： 30
キャリアガス： Ｈｅ
補給(make up)ガス： N2
FIDガス： Ｈ＋空気
脂肪酸メチルエステルの組成パーセントをモルパーセントとして算出する。12
未満の炭素鎖長については、理論的又は経験的レスポンス・ファクターを面積パ
ーセントの算出において用いることが望ましい。
6．計算
各sn−1及びsn−3位の各アシル基の平均分布を算出した。
平均sn−1及びsn−3組成＝（3ＷＯ組成−MAG組成）／2
WO＝全油
MAG＝モノアシルグリセロール
この分析の結果が表14に提示されている。GLA及びΔ6,918：2はsn−2及びsn−
1，3位の間で均等に分布する。この分析は、sn−1対sn−3位の脂肪酸を区別する
ことができない。
実施例14
トランスジェニック植物の脂肪酸組成
Δ5及びΔ6トランスジェニック植物をそれらの脂肪酸含量について分析した。
以下のプロトコルを油の抽出に用いた：
1．約400mgの種子を、各々のサンプルについて2回秤量した。
2．これらの種子を乳鉢及び乳棒で粉砕した。この乳鉢及び乳棒を3mlの（2：1
）（v：v）ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ／ＭｅＯＨで2回すすいだ。さらに6ml（2：1）
を20mlガラスバイアルに加えた（油を合計12ml 2：1中に抽出）。
3．サンプルを渦巻き攪拌し、オービタル・シェーカー上に時折攪拌しながら2
時間置いた。
4．5mlの１M ＮａＣｌを各サンプルに添加した。サンプルを渦巻き攪拌した後
、遠心機において2000rmpで5分間回転させた。パスツールピペットを用いて下相
を抜き出した。
5．上相をさらに5mlで再抽出した。サンプルを渦巻き攪拌した後、遠心機にお
いて2000rpmで5分間回転させた。パスツールピペットを用いて下相を抜き出し、
前の下相に添加した。
6．ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ／ＭｅＯＨを、窒素下で、気化冷却(evaporative co
oling)を用いて蒸発させた。抽出油を収容するバイアルを窒素の下で密封した。
各々のサンプルについて120mg−160mgの油を抽出した。
GC−MS分析のため、脂肪酸メチルエステルを適切な容量のヘキサンに溶解し、
30m×0.32mm内径、Omegawax 320溶融シリカキャピラリーカラム（Supelco、Bell
efonte、PA）及びHewlett−Packard 5972シリーズ質量選択検出器（mass select
ive detector）を備えるHewlett−Packard 5890 Series II Plusガスクロマトグ
ラフィー（Hewlett Packard、Palo Alto、CA）を用いて分析した。質量スペクト
ルを、MS Chem Station（＃G1036A）（Hewlett Packard）を用いてNIST／EPA／N
IH Chemical Structure Databaseにおける質量スペクトルと比較することにより
解釈した。
トランスジェニック系統5531−6を2回（A、B）分析し、対照系統LP004−6
と比較した。脂肪酸プロフィールの結果を表15に示す。
トランスジェニック系統5538−19を2回（A、B）分析し、対照系統LP004−6と
比較した。脂肪酸プロフィールの結果を表16に示す。
実施例15
交雑により達成される、アブラナ(b．napus)における
Δ6及びΔ12デサチュラーゼの組み合わせ発現
Δ6又はΔ12デサチュラーゼのいずれかを含む植物を交雑させ、個々のF1半種
子を脂肪酸組成についてGCにより分析した。そのような交雑種の1つからのデー
タを表17に示す。この交雑のための親は5538−LP004−25−2−25（Δ6発現体）
及び5542−SP30021−10−16（Δ12発現体）であった。正逆交雑(reciprocal cro
sses)を作製した。各々の25個の独立F1種子の結果を表に示す。交雑種は示され
る最初の親が雌性であるように記述される。交雑種の組の両者からほぼ同じ結果
が得られた。親と比較すると、Δ6,918：2は減少し、GLAは増加した。その上、
Δ9,1218：2の量もほとんどのF1において増加する。これらはF1種子であり、各
々のデサチュラーゼの1組のみを含むことに注意されたい。先の世代及び各デサ
チュラーゼについてホモ接合である結果物(event)の選択においては、得られるF
2 GLA量はさらに高いものであり得る。
交雑による組み合わせ形質は、ある状況において1つのT−DNA上で形質を組み
合わせるのに好ましいものであり得る。特に、両遺伝子が同じプロモーター（こ
の場合にはナピン）で駆動される場合には、プロモーターの静止化を発動するこ
とが複数のcDNAを1つの構築体に配することよりもこのアプローチに好ましいも
のであり得る。
あるいは、幾つかの場合においては、1つのT−DNA上で複数のcDNAを組み合わ
せることが選り抜きの方法であり得る。これらの結果を表17に示す。
実施例16
ダイズにおけるM．アルピナ・デサチュラーゼの発現
M．アルピナ・デサチュラーゼは、以下の発現構築体を用いることにより、ダ
イズにおいてGLA及び他のPUFAの産生を駆動させるのに用いることができる。ア
グロバクテリウム感染又は粒子銃が外来性DNAをダイズゲノムに挿入することが
できる2つの手段である。粒子銃形質転換は米国特許第5,503,998号に開示されて
いる。植物はグリフオセート耐性マーカー（4,971,908）を用いて選択すること
ができる。ダイズのアグロバクテリウム形質転換は当業者にとって確立されたも
のである。
種子特異的発現のため、デサチュラーゼcDNAのコーディング領域を、Glycine
max α型βコングリシニン貯蔵タンパク質遺伝子の5’調節領域の制御下に置く
。用いることができるこの特定の領域はgi 169928（Doyle，J.J.，Schuler，M.A
.，Godette，W.D.，Zenger，V.，Beachy，R.N.，and Slightom，J.L.，1986 J．
Biol．Chem．261(20)，9228-9238）のヌクレオチド78−921である。用いること
ができる3’調節領域はエンドウマメリブロース1，5ビスホスフェートカルボキ
シラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット（rbcS）遺伝子に由来するものである
。用いられる特定の配列は、gi 169145（Hunt，A.G．1988 DNA 7:329-336）のヌ
クレオチド1−645である。
ダイズ種子はアブラナ属よりも多くの18：2、及び、おそらくは多くの内在性
Δ12デサチュラーゼ活性を有するため、最適GLA量の達成に対するMortierellaΔ
12デサチュラーゼの効果を以下のように試験することができる。Δ6 cDNAを含
む構築体は、Δ6,918：2がGLAと共に産生されるかどうかを調べるのに用いるこ
とができる。Δ12デサチュラーゼを含む構築体は、ダイズにおいて18：2の量を
増加させることが可能かどうかを調べるのに用いることができる。Δ6及びΔ12
デサチュラーゼの両者を含む構築体は、最適量のGLAを産生させるのに用いるこ
とができる。その代わりに、必要であれば、単一のデサチュラーゼの各々を含む
植物を交雑させてそれらの遺伝子を組み合わせることができる。
Δ5デサチュラーゼを単独で、又はΔ12及び／又はΔ6デサチュラーゼと組み
合わせて発現させるために、類似の構築体を作製することができる。
実施例17
ヒトデサチュラーゼ遺伝子配列
長鎖多不飽和脂肪酸生合成に関与している可能性のあるヒトデサチュラーゼ遺
伝子配列を、ヒトcDNA配列とMortierella alpinaのデサチュラーゼ遺伝子配列と
の相同性に基づいて単離した。膜結合デサチュラーゼに保存されていることが知
られている３種の保存「ヒスチジンボックス」が認められた。他のいくつかの膜
結合デサチュラーゼのように、最終HXXHHヒスチジンボックスモチーフがQXXHHで
あることが判った。推定上のヒトデサチュラーゼのアミノ酸配列は、M．alpina
Δ5、Δ6、Δ9、及びΔ12デサチュラーゼとの相同性を示した。
M．alpinaΔ5-デサチュラーゼ及びΔ6デサチュラーゼcDNA配列を用いて、Incy
te Pharmaceuticals，Inc.，Palo Alto，California 94304のLifeSeqデータベー
スをサーチした。Δ5デサチュラーゼ配列は、断片1）アミノ酸番号1〜150、2）
アミノ酸番号151〜300、及び3）アミノ酸番号301〜446に分けられた。Δ6デサチ
ュラーゼ配列は、3つの断片、1）アミノ酸番号1〜150、2）アミノ酸番号151〜30
0、及び3）アミノ酸番号301〜457に分けられた。これらのポリペプチド断片につ
いて、"tblastn"アルゴリズムを用いてデータベースを検索した。このアルゴリ
ズムは、タンパク質のクエリー配列を、(両鎖の)6種の全てのリーディングフレ
ームに動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較するアルゴリズム
である。
M．alpinaΔ5及びΔ6のポリペプチド断片２及び３は、表18に概要を示したClo
neID配列と相同性を有する。このCloneIDはIncyte LifeSeqデータベースからの
個々の配列を示す。"tblastn"の結果を検討した後、異なるCloneID番号について
、>=50の厳密性(Stringency)、及び<=100の積スコア(Productscore)のデフォル
トの設定でクローン情報(Clone Information)を検索した。クローン情報結果(Cl
one Information Results)は、ClusterID、CloneID、Library、HitID、Hit Desc
riptionを含む情報を表示する。選択時に、ClusterID番号はそのClusterIDに属
する全てのクローンのクローン情報を表示する。Assembleコマンドにより、その
ClusterIDを含む全てのCloneIDが集められる。以下のデフォルト設定は、GCG(Ge
netic Computer Group，University of Wisconsin
Biotechnology Center，Madison，Wisconsin 53705)Assemblyのために用いられ
たものである。
ワードサイズ(Word Size):７
最少重複(Minimum Overlap):14
厳密性(Stringency):0.8
最少同一性(Minimum Identity):14
最大ギャップ(Maximum Gap):10
ギャップ重み(Gap Weight):８
長さ重み(Length Weight):２
GCG Assembly Resultsは、CloneID内の配列情報に基づいて生成されたコンテ
ィグを表示した。コンティグはこれらの配列間の相同な領域に基づくDNA配列の
アライメントである。コンティグ内においてアライメントされたDNA配列に基づ
いて新たな配列(コンセンサス配列)を生成した。CloneIDを含むコンティグが同
定され、コンセンサス配列の曖昧な部位はCloneIDのアライメント(配列番号31〜
配列番号35参照)に基づいて編集し、最も可能性の高い配列を生成した。この手
順を表18に挙げた６種の全てのCloneIDについて繰り返した。これにより５種の
ユニークなコンティグが生成された。５種のコンティグの編集されたコンセンサ
ス配列を、Sequencherソフトウェアプログラム(Gene Codes Corporation，Ann A
rbor，Michigan 48 105)にインポートした。これらのコンセンサス配列を組み立
てた。コンティグ2511785はコンティグ3506132と重複しており、この新たなコン
ティグは2535(配列番号37)と称する。Sequencherプログラムからのコンティグを
、GCGのSequence Analysisソフトウェアパッケージにコピーした。
６種の全てのリーディングフレームにおいて各コンティグをタンパク質配列に
翻訳した。M．alpinaΔ5(MA29)及びΔ6(MA524)配列を、FastAサーチ(クエリー配
列及び同じ種類(核酸またはタンパク質)の配列群との間の類似性についてのPear
son and Lipmanサーチ)を用いて、翻訳された各コンティグと比較した。これら
の配列間の相同性は、各コンティグのオープンリーディングフレームを示唆
するものである。コンティグ2535及び3854933に対するM．alpinaΔ5及びΔ6の間
の相同性を利用して、253538aと称する最終コンティグを形成した。図９は、最
終コンティグ253538aとMA29とのFastAマッチであり、図10は、最終コンティグ25
3538aとMA524とのFastAマッチである。種々のコンティグのDNA配列を配列番号31
〜配列番号37に示す。種々のペプチドの配列を配列番号38〜配列番号44に示す。
２つのコンティグを合わせることによりオープンリーディングフレームが生成
されるが、コンティグ2535はこのコンティグの最初の部分にコンティグ3854933
と一致しないユニークな配列が存在することを示している。従って、これらのコ
ンティグがヒト遺伝子のような独立したデサチュラーゼから生成されたものであ
る可能性がある。
コンティグ253538aは、432個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフ
レームを含む。このオープンリーディングフレームはGln(CAG)から始まり、終止
コドン(TGA)で終わる。コンティグ253538aはM．alpinaΔ5及びΔ6配列の双方と
アライメントされ、これはこのコンティグが前記デサチュラーゼの何れかで有り
得るとともに、互いに相同性を共有する他の公知のデサチュラーゼであり得るこ
とを示唆している。表18に挙げた個々のコンティグ並びに中間コンティグ2535及
び最終コンティグ253538aを利用してヒトデサチュラーゼの完全な遺伝子を単離
することができる。
ヒトデサチュラーゼの使用
これらのヒト配列は、先の実施例で説明した手順を用いて酵母及び植物で発現
することができる。哺乳動物細胞及びトランスジェニック動物での発現について
は、これらの遺伝子は優位コドンバイアスを与え得る。さらに、これらの配列は
、他の生物由来の関連デサチュラーゼ遺伝子を単離するために用いることもでき
る。
実施例18
M．alpinaΔ5及びΔ6デサチュラーゼの相同体の同定
推定上のΔ5デサチュラーゼをコードする核酸配列を、Ma29のアミノ酸100-446
をクエリーとして用いたNCBIによる発現した配列タグのデータベースのTBLASTN
サーチにより同定した。Ma29配列の切断された一部分を用いて、デサチュラーゼ
のN末端におけるチトクロームb5部分に基づく相同性を選択することを回避した
。Dictyosterium discoideum(受託番号C25549)からのestの推定アミノ酸配列はM
a29に対して非常に有意な相同性を示し、そしてMa524に対してもそれより低い程
度であるが依然として有意な相同性を示す。このDNA配列を配列番号45として示
す。アミノ酸配列を配列番号46として示す。
実施例19
他のPUFA産生生物におけるM．alpinaΔ5及びΔ6相同体の同定
PUFAの産生に関与するデサチュラーゼを得るために、Phaeodactylum tricornu
tum種から単離された全RNAからcDNAライブラリーを構築した。プラスミドベース
のcDNAライブラリーを、市販のキット(GIBCO-BRL)をその使用説明書に従って用
いて、pSPORT1(GIBCO-BRL)中に構築した。無作為なcDNAクローンを配列決定し、
推定されるΔ5またはΔ6デサチュラーゼをコードする核酸配列を、データベース
のBLASTサーチ及びMa29及びMa524配列との比較によって同定した。
Ma29及びMa524と相同性を有する１種のクローンがPhaeodactylumライブラリー
から同定された。これを144-011-B12と称する。このDNA配列を配列番号47として
示す。アミノ酸配列を配列番号48として示す。
実施例20
他のPUFA産生生物におけるM．alplnaΔ5及びΔ6相同体の同定
PUFAの産生に関与するデサチュラーゼを得るために、Schizochytrium種から単
離された全RNAからcDNAライブラリーを構築した。プラスミドベースのcDNAライ
ブラリーを、市販のキット(GIBCO-BRL)をその使用説明書に従って用いて、pSPOR
T1(GIBCO-BRL)中に構築した。無作為なcDNAクローンを配列決定し、推定される
Δ5またはΔ6デサチュラーゼをコードする核酸配列を、データベースのBLASTサ
ーチ及びMa29及びMa524配列との比較によって同定した。
Ma29及びMa524と相同性を有する１種のクローンがSchizochytriumライブラリ
ーから同定された。これを81-23-C7と称する。このクローンは約1kbのインサー
トを含む。ユニバーサルフォワード及びリバースシークエンシングプライマーを
用いてクローンの各末端から部分配列を得た。フォワードプライマーから得たDN
A配列を配列番号49として示す。そのペプチド配列を配列番号50として示す。リ
バースプライマーから得たDNA配列を配列番号51として示す。リバーズプライマ
ーから得られたアミノ酸配列を配列番号52として示す。
実施例21
栄養組成物
上記実施例のPUFAは、様々な栄養補助剤、乳幼児用配合物、栄養代用物やその
他の栄養液に用いることが出来る。
Ｉ 乳幼児用配合物
用法：牛乳にアレルギーや不耐症を持つ乳幼児、小児、成人の飲用。ラクトー
スを避けなければならない障害（ラクターゼ欠損症、ラクトース不耐症、ガラク
トース血症）の患者の食餌
特徴：
・大豆タンパク質単離物により牛乳由来タンパク質へのアレルギー、過敏症の症
状を防ぐ
・ラクトース非含有の組成がラクトース性の下痢を防ぐ
・低いオスモル濃度（240mOsm/kg水）が浸透圧性の下痢の危険を抑える
・２種の炭水化物（コーンシロップ、ショ糖）が炭水化物の吸収を促進するよう
に設計されており、弱った腸の吸収力を超過する危険を抑える
・100カロリーあたり1.8mgの鉄分（硫酸第一鉄として）が鉄分欠乏症を防ぐ
・推奨量のビタミン、ミネラル
・植物油により推奨量の脂肪酸を供給
・乳白色、牛乳と同程度のコンシステンシー、心地よい香り
1.9%大豆タンパク質単離物、1.4%ココナッツオイル、0.15%クエン酸カルシウム
、0.11%リン酸カルシウム三塩基、クエン酸カリウム、リン酸カリウム一塩基、
塩化カリウム、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、ア
スコルビン酸、L-メチオニン、塩化マグネシウム、リン酸カリウム二塩基、塩化
ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、酢酸α-ト
コフェリル、硫酸亜鉛、L-カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシ
ウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビ
ン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、
ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
用法：乳幼児の下痢時食餌管理における短期間の食餌
特徴：
・第一乳幼児用配合物は特に整腸用に添加された大豆繊維由来の食物繊維を含む
・乳幼児の中程度から重度の下痢において、ゆるく水っぼい便の期間を短縮する
ことが臨床的に示されている
・乳幼児の栄養学的要求を完全に満たしている
・大豆タンパク質単離物と添加L-メチオニンは乳幼児の必要とする全ての必須ア
ミノ酸量に合致またはそれを上回っている
・ラクトース非含有の配合がラクトース性下痢を防ぐ
・低いオスモル濃度（240mOsm/kg水）が浸透圧性の下痢の危険を抑える
・２種の炭水化物（コーンシロップ、ショ糖）が炭水化物の吸収を促進するよう
に設計されており、弱った腸の吸収力を超過する危険を抑えている
・アメリカ小児科学会栄養学委員会の推薦値、乳幼児調合乳法の要求値を満たす
かまたは上回るビタミンとミネラルのレベル
・100カロリーあたり1.8mgの鉄分（硫酸第一鉄として）が鉄分欠乏症を防ぐ
・植物油により推奨量の脂肪酸を供給
2.0%大豆タンパク質単離物、1.4%ココナッツオイル、0.77%大豆繊維、0.12%クエ
ン酸カルシウム、0.11%リン酸カルシウム三塩基、0.10%クエン酸カリウム、塩化
カリウム、リン酸カリウム一塩基、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチ
ン、カラゲナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、L-メチオニン、硫酸カリ
ウム二塩基、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシト
ール、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、L-カルニチン、ナイアシンアミド、パ
ントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩
酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム
、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコ
バラミン
用法：牛乳のタンパク質に対するアレルギーや過敏症またはショ糖への不耐症
を持つ乳幼児、小児、成人の飲用。ラクトース、ショ糖を避けなければならない
疾患を有する患者の食餌。
特徴：
・大豆タンパク質単離物により牛乳由来タンパク質へのアレルギー、過敏症の症
状を防ぐ
グルコースポリマー）
・ショ糖不耐性患者のためにショ糖非含有
・低いオスモル濃度（180mOsm/kg水）が浸透圧性の下痢の危険を抑える
・100カロリーあたり1.8mgの鉄分（硫酸第一鉄として）が鉄分欠乏症を防ぐ
・推薦量のビタミン、ミネラル
・植物油により推奨量の脂肪酸を供給する
・乳白色、牛乳と同程度のコンシステンシー濃度、心地よい香り
豆タンパク質単離物、2.8%ココナッツオイル、1.0％改質コーンスターチ、0.38%
リン酸カルシウム三塩基、0.17%クエン酸カリウム、0.13%塩化カリウム、モノグ
リセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、
L-メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラゲナン、タ
ウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、L-カ
ルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチ
ン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸
、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリ
ウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
用法：大豆食餌が望ましい場合
1.9%大豆タンパク質単離物、1.4%ココナッツオイル、0.15%クエン酸カルシウム
、0.11%リン酸カルシウム三塩基、クエン酸カリウム、リン酸カリウム一塩基、
塩化カリウム、モノグリセリド、ジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、ア
スコルビン酸、L-メチオニン、塩化マグネシウム、硫酸カリウム二塩基、塩化ナ
トリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、酢酸α-トコ
フェリル、硫酸亜鉛、L-カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウ
ム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン
、塩
酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチ
ン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
用法：乳幼児用配合物が必要なとき：一歳児になる前に母乳を中止する決定が
なされたとき、母乳の補助が必要なとき、あるいは母乳を使用していない場合に
通常の食餌として
特徴：
・良好な成長に適した質、量のタンパク質、熱変性され乳性腸失血の危険を低減
する
・植物油混合物（二回ホモゲナイズしたもの）由来の脂肪が、容易に吸収される
必須のリノール酸を供給する
・ラクトースとしての炭水化物中の比率が母乳におけるものと類似する
・低腎溶質負荷が発達中の器官の負担を最小化する
・粉末、濃縮液体、及びそのまま摂取できるものの三種の形態
セリド、ジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラゲナン、塩化コリ
ン、タウリン、m-イノシトール、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシン
アミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタ
ミンA、塩化チアミン塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マ
ンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンD3、及びシ
アノコバラミン
用法：退院後の未熟児の特別な栄養要求用。Similac NeoCareは、未熟児の成
長を追いつかせ、発達を支持するために必要なカロリー、タンパク質、ビタミン
、及びミネラル分を追加した、栄養学的に完全な配合物である。
特徴：
・カロリーとビタミンの補助の必要性を低減する。標準期間配合物（20Cal/fl o
z）よりも多いカロリー（22Cal/fl oz）
・中鎖トリグリセリド（MCTオイル）を配合した高吸収性混合脂肪が未熟児の特
別な消化の要求に答えるのを助ける
・100カロリーあたりのより高いレベルのタンパク質、ビタミン、及びミネラル
が、入院時に始められた栄養学的支持を延長する
・骨の石化改良のためのより多くのカルシウムとリン酸
大豆油、高オレイン酸ベニバナ油、分画化ココナッツオイル(中鎖トリグリセリ
ド)、ココナッツオイル、クエン酸カリウム、リン酸カルシウム三塩基、炭酸カ
ルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム
、タウリン、硫酸第一鉄、m-イノシトール、塩化コリン、パルミチン酸アスコル
ビル、L-カルニチン、酢酸α-トコフエリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混
合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅
、塩化チアミン塩酸塩、パルミチン酸ビタミンA、βカロテン、リボフラビン、
塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸
ナトリウム、ビタミンD3、及びシアノコバラミン
G． Similac Natural Care低鉄分母乳増強剤、そのまま使用可能、24Cal/fl oz
用法：母乳混合用あるいは低出生体重児に母乳に代替して給餌するために設計
ナッツオイル(中鎖トリグリセリド)、乳清タンパク質濃縮物、大豆油、ココナッ
ツオイル、リン酸カルシウム三塩基、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、ク
エン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノグリセリド、ジグリ
セリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化コリン、m-イノシトール、タウリン、
ナイアシンアミド、L-カルニチン、酢酸α-トコフェリル、硫酸亜鉛、塩化カリ
ウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、パル
ミチン酸ビタミンA、塩化チアミン塩酸塩、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸
、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンD3、亜セレン酸ナトリウム、及びシア
ノコバラミン
本発明の種々のPUFAは、上記の乳幼児用配合物及び当業者に知られるその他の
乳幼児用配合物に代替し及び／またはそれらに添加し得る。
II 栄養配合物
